RNA作为遗传媒介,在基因表达调控等许多生命活动中起着重要的作用。真核生物中,RNA在转变成为有功能的mRNA之前需要经过pre-mRNA的剪接加工。同时,许多RNA在生理、病理状态下表现出了组织特异性,如许多miRNA在不同组织中数量、种类差异非常大。不论是RNA的转录后加工还是RNA的组织特异性表达,都在生理进程中发挥了非常重要的作用。为了研究这些RNA参与的生命活动,需要对其进行含量检测。最初,研究人员通过RT-PCR扩增技术、Northern杂交、RT-qPCR、微阵列技术和RNA-seq技术等对RNA含量进行检测。然而,这些方法需要对组织样品进行破坏,所以不能实时动态提供RNA含量变化的信息。RNA的表达在生命活动中是动态变化的,这就需要对其进行实时动态的监测,以便更加准确的研究相关的生命活动。报告基因系统由于能够利用细胞内的组装元件进行在体组装表达,直接在体内产生可检测的信号分子,可以实时对细胞内的相关RNA变化做出相应的应答,实现实时在体检测RNA的含量变化,是RNA检测的重要工具。同时报告基因能够更加真实的模拟体内的生物、生化反应,更加真实的模拟体内RNA的加工过程,检测的结果更加接近机体的真实生理进程。本研究,我们开发了三种荧光素酶报告基因显像系统,以此动态监测体内RNA的含量变化,为RNA的含量检测提供了动态的检测工具。1、基于内含子保留的报告基因系统构建及其在体显像检测。真核生物中,pre-mRNA的剪接是DNA与蛋白质发生信息交换的一个关键步骤。本章节,我们构建了内含子保留的报告基因系统Rluc-intron,实时无创的监测细胞及活体动物pre-mRNA的剪接进程。我们将Rluc基因插入到人TPI基因内含子序列中。通过剪接调节剂的作用,实时动态监测了该报告基因在细胞及活体动物中的剪接进程。通过报告基因活性验证及报告基因对不同浓度剪接抑制剂的响应等实验,我们证明了Rluc-intron报告基因显像系统可以响应剪接调节剂对pre-mRNA的剪接调节作用,实时动态地提供pre-mRNA在细胞水平和活体动物中的剪接动态信息,实现了活体pre-mRNA的剪接分子显像检测。2、两步放大的报告基因系统模拟pre-mRNA剪接的在体显像研究。上一章节,通过将Rluc基因插入到内含子序列中,构建了一个检测pre-mRNA剪接进程的报告基因显像系统。然而,当剪接过程几乎完全发生时,海肾荧光素酶基因随着内含子一同被去除,此时,很难检测由海肾荧光素酶基因产生的荧光信号。因此,该系统很难反映剪接调节剂对剪接调控的微弱活性作用。为了克服这个缺陷,本章节,利用GAL4-VP16对UAS的激活作用,引起UAS下游萤火虫荧光素酶基因的表达增强,设计了一个pre-mRNA关联的GAL4-VP16显像系统,用于pre-mRNA在体剪接进程的动态研究。通过细胞和活体动物中实时动态的荧光信号检测,我们证明,该报告基因系统可以很好的响应剪接抑制剂对pre-mRNA的剪接抑制作用,实时在体检测了pre-mRNA的剪接进程。这将有效的扩充了内含子保留的报告基因显像系统用于pre-mRNA的实时动态监测的应用范围,为pre-mRNA剪接的体内外显像研究进一步提供了有力的工具。3、双荧光素酶报告基因系统的设计及其在神经分化进程中miRNA的检测应用。监测神经分化进程对于研究神经元的发育和神经退行性疾病的干细胞治疗有着至关重要的作用。本章节,我们开发了一种双荧光素酶报告基因系统,用来监测神经特异性miRNA-9和miRNA-124a分子的体内外表达变化。该miRNA应答的报告基因显像系统通过将萤火虫荧光素酶基因和海肾荧光素酶基因插入到同一质粒载体中,分别由两个不同的启动子启动转录,同时在萤火虫荧光素酶基因的3’非编码区插入了与miRNA-9或miRNA-124a完全互补的三个重复序列,以此响应相应的miRNA的表达变化。海肾荧光素酶基因不受miRNA的调控,可以独立表达,作为对照。通过转染外源miRNA,我们证明该双荧光素酶报告基因系统可以有效地检测miRNA的含量变化,并且表现出特异性响应。同时我们以P19细胞定向分化为神经细胞为模型,利用该报告基因,成功检测了P19细胞分化进程中细胞内和活体动物中miRNA-9和miRNA-124a的含量变化。该双荧光素酶报告基因系统为miRNA的在体连续监测提供了一个非常有力的显像工具。