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自从1918年西班牙大流感导致约5000万人死亡,世界范围内的流感大流行并没有停止。流感病毒容易受环境、宿主等因素的影响发生突变产生新的流感病毒亚型,这为流感病毒的预防和治疗增加了难度。从人们发现非编码RNA并非遗传基因组中的“垃圾信息”到现在,已经过去的二十多年间,有大量的功能性非编码RNA被发现和证实。越来越多的研究涉及到表观遗传学领域。 首先通过高通量筛选感染/未感染H1N1的猪肺泡巨噬细胞中感染后发生差异表达的microRNAs,从中挑选出差异表达量显著的miR30d进行研究,合成的miR30d mimic可以抑制H1N1亚型流感病毒在A549细胞中的毒力。接下来通过miRNA靶基因在线预测软件RNA hybrid对miR30d与流感病毒8个基因片段的靶点分析,发现miR30d与NP基因之间存在靶向关系。用G和C将miR30d的非seed区序列中的A和U替换后得到miR30d_TR序列。利用RNA hybrid分析miR30d TR与NP的靶向关系,其MFE值为-32.8 kcal/mol,miR30d与NP的MFE值为-27.6 kcal/mol。MiR30d_TR的GC含量达到73%,相比于miR30d序列的50%有很大的提高。为进一步验证序列稳定性增加对miR30d抑制流感病毒复制能力的影响,合成miR30d_TR mimic,同时miR30d与miR30d_TR序列分别克隆至plko.1载体,通过瞬时转染的方式将mimic和载体分别转染至A549细胞,通过检测感染H5N1后的细胞上清中病毒毒力和细胞总蛋白中NP蛋白的表达量,发现miR30d_TR比miR30d更有效地抑制流感病毒在细胞中的复制能力。 我们利用三质粒慢病毒包装系统分别将miR30d和miR30d_TR的前体序列连接至plko.1质粒后进行包装。通过筛选和浓缩,通过尾静脉注射的方法将包装的慢病毒注射进小鼠体内,滴鼻感染H5N1后观察14天,lenvi-miR30d_TR组小鼠体重在感染后第10天恢复正常,并且存活率达到100%。Lenvi-miR30d组小鼠有1只死亡。对照组小鼠死亡率在第9天达到最大值为50%。小鼠肺组织HE染色结果表明,除PBS组外,各组小鼠的肺组织病变程度不同。lenvi-miR30d和lenvi-miR30d_TR组小鼠肺组织少见肺泡内出血、炎性细胞集聚现象,未见肺泡壁增厚现象。对肺组织中H5N1病毒滴度检测发现,lenvi-miR30d组小鼠肺脏病毒滴度是lenvi-miR30d_ TR组的1.5-2倍的logs of TCID50,而对照组小鼠肺脏病毒滴度是lenvi-miR30d组的1.5倍的logs of TCID50。小鼠实验验证了miR30d在细胞水平对于流感病毒H5N1亚型的抑制效果。 体内和体外实验表明miR30d_TR相对于miR30d对于流感病毒的毒力的抑制作用更为有效,同时也揭示了miR30d_ TR作为新的抗流感靶向药物的可能性。