太湖土著藻毒素降解菌S11的降解特性与固定化研究

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太湖流域位于我国长江中下游,地处我国经济发展最为发达的长江三角洲,是上海、苏州、无锡、常州等中国最高人口密度城市的主要饮用水水源。近年来,随着大量工农业和生活污水排入太湖,导致湖泊富营养化严重,有毒蓝藻水华(HCBs)频繁爆发,对湖泊生态环境和周围居民的生活带来很大影响。而蓝藻水华产生的藻毒素,更严重威胁到人类健康。研究显示,土著藻毒素降解菌去除藻毒素具有成本低、效率高、相对安全和利于生态修复的优点,具有较好的应用前景。本论文从太湖成功分离筛选鉴定出太湖土著藻毒素降解菌S11,对其藻毒素降解能力、降解效果和降解机制展开了系统研究,并构建了藻毒素降解菌-人工介质复合体技术对其进行固定化研究。为藻毒素降解菌应用于藻毒素去除和水环境修复提供理论基础和科学依据。  一,太湖土著藻毒素降解菌S11的分离、筛选与鉴定  以购买藻粉为原料,采用组织研磨超声破碎,70%甲醇萃取,等电子点去除藻胆蛋白等步骤,构建藻毒素粗提物制备方法;采用高效液相色谱法,构建藻毒素检测方法。从太湖水域宜兴市周铁镇符渎港蓝藻堆积点采取样品,对其进行驯化培养、分离纯化得到藻毒素降解菌,采用分子生物学方法对其进行鉴定。结果显示,藻粉提取法是快速、高效、可行的藻毒素粗提物提取方法,14 g藻粉约获得2000μg MC-LR;采用高效液相色谱法测量藻毒素含量,对藻毒素检测的浓度范围为0.1-10.0μg/mL,建立的MC-LR和MC-RR的标准曲线分别为:y=45.236x-5.465(R2=0.9991),y=60.818x+0.7245(R2=0.9990);从宜兴市周铁镇符渎港采集样本,发现蓝藻堆积点菌群对藻毒素具有藻毒素降解能力,经驯化培养、分离、纯化得到1株太湖土著高效藻毒素降解菌菌株S11,菌株单菌落呈圆形,边缘整齐,颜色为白色,表面光滑,不粘稠,易挑取,革兰氏阴性;对其进行分子生物学鉴定,表明该菌属于嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)。  二,太湖土著藻毒素降解菌S11的降解特性及机制研究  以筛选分离纯化到得到的太湖土著藻毒素降解菌S11为研究对象,接种至以藻毒素为主要(或唯一)碳源氮源的培养基进行培养,描绘了生长曲线,分别研究其对藻毒素标准品、藻毒素粗提物中藻毒素和太湖水样中藻毒素的降解能力,绘制降解曲线,评价降解效率;并通过对持续驯化6个月、冷冻保存6个月和停止驯化后传代9次后S11的降解能力研究,探索菌株S11降解能力稳定性;分别采用不同的温度(20℃、30℃、37℃)、pH值(6、7、8)、藻毒素初始浓度(MC-RR浓度37.13 mg/L、18.57 mg/L、9.08 mg/L和MC-LR浓度18.48 mg/L、9.56 mg/L、4.82 mg/L)和菌株接种量(5%、10%、20%)对菌株S11进行藻毒素降解实验,研究其影响因素。设计特异性引物,利用PCR扩增获得藻毒素降解过程中的关键酶基因mlrA,并对其进行测序;利用高效液相色谱、高效液相色谱-飞行时间质谱连用分析菌株S11作用后的藻毒素MC-LR中间产物,从而探讨藻毒素降解菌S11可能的降解途径。结果显示,在含藻毒素粗提物的MSM培养基、含MC-LR标准品的MSM培养基和太湖蓝藻堆积点水样中,菌株S11均能良好生长,并能将MC-RR和MC-LR降解至检出限以下,平均降解速率可高达5.68 mg/(L·d)和3.08 mg/(L·d);菌株S11的藻毒素降解能力在长期冷冻保存后和停止驯化3~6代之间可能会消失,但保存持续驯化或者停止驯化3代内,能够保持很好的藻毒素降解能力;菌株S11能够在20℃到37℃温度范围内有效降解藻毒素MC-RR和MC-LR,降解速率随温度升而增加,能够在pH值范围6~8内完全降解藻毒素MC-RR和MC-LR,最适酸碱环境为弱酸性和中性;菌株S11最适降解条件为30℃,pH=7,接种量10%;菌株S11对藻毒素的降解存在停滞期,并随降解底物中藻毒素浓度的增加而延长,在对藻毒素标准品为唯一碳源氮源的培养环境中,停滞期消失。菌株S11含有藻毒素降解关键酶基因mlrA的同源基因,并能在降解中间产物中检测到四肽(m/z615.3390)和Adda(m/z332.2208)离子碎片,其降解途径与部分文献报道的降解途径一致。  三,太湖土著藻毒素降解菌S11的固定化研究  利用自行设计制作微生物-人工介质复合体装置,采用接种挂膜法将筛选分离得到的太湖土著高效藻毒素降解菌S11固定于人工介质,形成藻毒素降解菌-人工介质复合体;采用太湖蓝藻为原料,配置含藻毒素的模拟废水;分别监测间歇运行和持续运行状态下出水藻毒素浓度和出水COD、TP、TN等等指标,研究不同水力停留时间(HRT)对藻毒素去除效果和水质的影响;采用停止运行2、4月后再次运行,探索该装置对藻毒素降解的稳定性;利用海藻酸钠包埋筛选得到的太湖土著藻毒素降解菌S11,制得藻毒素降解菌包埋小体,评价包埋小体质量,将其分别投入含藻毒素粗提物的MSM培养基和模拟废水中,研究包埋小体对藻毒素的降解能力和重复利用情况。结果显示,利用太湖新鲜蓝藻为原料,成功配置出MC-LR浓度约为15μg/L的模拟废水;利用组合介质设计制作了藻毒素降解菌-人工介质固定化装置,采用接种挂膜法成功将太湖土著藻毒素降解菌S11进行固定;在间歇运行下,装置A、B都能有效降解MC-LR、COD和TP;装置停止运行2、4个月后进行间歇运行试验,仍可以完全降解MC-LR,具有较好的稳定性;连续运行下,水力停留时间(HRT)越长,该装置对MC-LR的降解作用越高,COD和TP降低越多;高曝气量有利于MC-LR的降解;利用海藻酸钠成功包埋太湖土著藻毒素降解菌S11,包埋小球成球容易,不易粘连,具有较好机械性和传质性;包埋小球能在3天内有效降解藻毒素粗提物中初浓度为2.56 mg/L的MC-LR,且用较少数量即能达到较高降解效果;能有效降解模拟废水中初浓度约为37.19μg/L的MC-LR,也对MC-RR有一定降解效果;同时,包埋小球具有一定的回收利用能力。
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