【摘 要】
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随着家禽养殖业的规模化、集约化和产业化迅速发展,应激反应带来的损失越来越严重,因此,对应激反应的的研究与防治需引起高度重视。胸腺是家禽T细胞分化、发育及成熟的场所,具有重要的免疫调节功能,应激导致的免疫抑制可通过胸腺内基因的变化影响到其免疫功能。目前关于应激影响家禽免疫功能的分子调控机制研究较少且不够深入。本研究以前期构建的皮质酮诱导的固始鸡雏鸡应激模型组和对照组胸腺为研究对象,通过转录组测序技术
【基金项目】
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河南省高等学校重点科研项目计划（21A230008）； 河南省科技攻关（222102110389）； 国家蛋鸡产业技术体系遗传育种岗位专项资金:农业部现代农业产业技术体系（NO. CARS-40-K04）； 教育部创新团队发展计划滚动支持项目:地方鸡种质资源保护与利用（NO. IRT16R23）；
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随着家禽养殖业的规模化、集约化和产业化迅速发展,应激反应带来的损失越来越严重,因此,对应激反应的的研究与防治需引起高度重视。胸腺是家禽T细胞分化、发育及成熟的场所,具有重要的免疫调节功能,应激导致的免疫抑制可通过胸腺内基因的变化影响到其免疫功能。目前关于应激影响家禽免疫功能的分子调控机制研究较少且不够深入。本研究以前期构建的皮质酮诱导的固始鸡雏鸡应激模型组和对照组胸腺为研究对象,通过转录组测序技术对应激模型组和对照组雏鸡胸腺中差异表达的m RNA及富集通路进行鉴定与分析,筛选出鸡胸腺应激性免疫抑制相关基因,并对候选基因HSPA8进行深入探讨,从个体和细胞水平研究该基因的免疫调控功能及其作用机制。个体水平上,构建了固始鸡断喙应激和热应激模型,研究断喙后1d、3d、5d和7d和持续热应激28d对机体血清生化指标和免疫相关指标的影响,并在断喙后的不同时间点和持续热应激鸡胸腺中验证HSPA8表达量的变化情况;以HSPA8基因的CDS区克隆序列为基础,通过生物信息学方法分析该基因的生物学特性和结构特点;细胞水平上,通过在HD11细胞系中过表达和干扰HSPA8及与LPS共处理试验,研究该基因对HD11细胞增殖、凋亡及免疫功能等的影响,探讨HSPA8在HD11细胞免疫应答过程中所发挥的作用。主要试验内容和结果如下:1.皮质酮处理雏鸡胸腺转录组学研究转录组测序结果显示,皮质酮处理组和对照组雏鸡胸腺中差异基因共101个,包括44个上调基因和57个下调基因。整合分析测序结果发现,XCL1、HSPA8、DMB1和BAG3等与免疫和应激相关性强,这些基因可能在应激影响鸡胸腺免疫功能的过程中具有潜在的调控作用。最终确定以候选基因HSPA8为后续研究对象,该基因在皮质酮处理组胸腺中的表达量显著低于对照组（P＜0.05）。2.在不同应激模型中验证候选基因HSPA8血清生化分析和ELISA结果显示,断喙应激和持续热应激均可显著促进鸡血清CORT含量的升高和IL-1β、IL-6和TNF-α的释放（P＜0.05）,显著降低CD3+和Ig G含量（P＜0.05）。qRT-PCR结果显示,鸡胸腺中IL-1β、IL-6、TNF-α和IL-8的表达量在断喙后第1d均显著升高（P＜0.05）,第5d均显著降低（P＜0.05）,在持续热应激组中显著升高（P＜0.05）;促凋亡基因表达量上升,抗凋亡基因下降;HSPA8在断喙后第1d、3d胸腺中的表达量显著升高（P＜0.05）,第5d显著降低（P＜0.05）,第7d无显著变化,在持续热应激组中显著降低（P＜0.05）。3.鸡HSPA8生物信息学和组织表达分析鸡HSPA8基因的CDS区长1941 bp,共编码646个氨基酸。生物信息学分析结果显示,鸡HSPA8蛋白属于带负电、稳定、亲水蛋白,无信号肽区域和跨膜结构域,有多个磷酸化和糖基化修饰位点;该蛋白主要在细胞核内发挥作用,有两个保守性结构域,与DNAJC5、HSPB1、DNAJA1和GAK等形成互作网络;鸡HSPA8基因与火鸡亲缘关系最近,与低等鱼类亲缘关系最远。组织表达谱结果表明,HSAP8在雏鸡各组织器官中广泛表达,在胰腺和肺中表达量最高,腿肌和胸肌中表达量最低。4.细胞水平研究HSPA8的基因功能CCK-8、EdU、流式细胞术及qRT-PCR结果表明,过表达HSPA8可显著升高HD11细胞活性（P＜0.05）,显著促进细胞增殖（P＜0.05）,显著抑制细胞凋亡（P＜0.05）,干扰则相反;过表达/干扰HSPA8与LPS共处理试验表明,过表达HSPA8可进一步促进LPS诱导的炎性细胞因子的表达,干扰则相反;过表达HSPA8可促进HD11细胞TLR4/My D88/NF-k B信号通路的激活,可显著上调MAPK信号通路中关键因子ERK、JNK和p38基因的表达（P＜0.05）,干扰则相反。综上所述,HSPA8在皮质酮诱导的固始鸡应激模型组胸腺中的表达量显著低于对照组;HSPA8在雏鸡断喙后第1d和3d胸腺中的表达量显著升高,第5d显著降低,第7d无显著变化,在持续热应激28d鸡胸腺中的表达量显著升高;HSPA8可促进HD11细胞增殖,抑制细胞凋亡,且参与调节HD11细胞的免疫反应,可促进LPS诱导的炎性细胞因子的表达;HSPA8可能对HD11细胞TLR4/My D88/NF-k B和MAPK信号通路的激活有促进作用。以上结果表明HSPA8参与调控家禽应激性免疫应答反应,可作为反应家禽是否处于应激性免疫抑制状态的可靠指标,本研究结果为解析应激影响家禽免疫功能的分子调控机制提供了理论基础和参考依据。
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