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近年来随着疾病诊断技术的进步和各种组学手段在病原菌鉴定方面的应用,研究发现多数慢性感染病灶是由多种病原菌共同定殖。铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是两种常见的病原菌,通常可在免疫功能受限的病人,尤其在罹患遗传性肺脏囊胞纤维症和慢性阻塞性肺病的病人中共同分离得到。定殖于同一病灶的多种病原菌之间可进行频繁的物理或化学物质交流,并且协同促进病情的发展和慢性病征的维持。作为治疗细菌感染的首选化学药物,抗生素的介入是否会影响病原菌种间交流,具体以何种机制影响病原菌种间互作,这些问题目前在国际上研究较少。因此,本文主要聚焦抗生素背景下铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌的种间互作机制进行了如下研究:(1)按照临床和实验室标准化研究所(Clinical and Laboratory Standards Institute)制定的抗菌药物敏感性试验执行标准,通过微量肉汤稀释法分别测定慢性呼吸道感染临床常用药物对铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度。结果表明,铜绿假单胞菌模式菌株PAO1和铜绿假单胞菌临床分离菌株COP2(PA-COP2)对四环素、氨苄西林、链霉素和头孢噻肟耐药;耐甲氧西林金黄色葡萄球菌COP112(MRSA-COP112)则对妥布霉素、庆大霉素、四环素、氨苄西林、头孢噻肟和链霉素耐药。(2)分别构建有/无抗生素干预背景下PAO1、PA-COP2与MRSA-COP112的平板草坪和平板距离试验发现,当无抗生素干预时,铜绿假单胞菌与金黄色葡萄球菌相比具有显著的竞争优势,并且能对邻近的金黄色葡萄球菌表现出明显的抑制作用,金黄色葡萄球菌则对铜绿假单胞菌的生长没有显著的影响;然而,当存在氨基糖苷类抗生素干预时,具有更高抗性的MRSA-COP112能够抑制铜绿假单胞菌的生长,尤其是在链霉素存在时抑制效果更加明显。(3)通过构建有/无链霉素干预背景下PA-COP2和MRSA-COP112的1:1、1:9、9:1的混合比例平板竞争试验发现:在空白平板上共培养时,PA-COP2的相对适应度更高;另一方面,尽管在链霉素平板上MRSA-COP112对PA-COP2的入侵相对较难,但无论初始比例如何,MRSA-COP112都能主导与PA-COP2之间的竞争关系。此外,通过上述混合比例平板竞争试验构建数学模型,发现具有非对称竞争优势的细菌种群之间的内在相互作用关系可被抗生素的存在所逆转,抗生素的间歇性使用可能引起其共现频率的周期性变化。(4)为了进一步阐明链霉素干预背景下PA-COP2与MRSA-COP112种间互作过程中胞内表达调控的变化,对不同培养条件下PA-COP2纯培养、MRSA-COP112纯培养和PA-COP2与MRSA-COP112混合培养进行了转录组测序。与未处理的对照组相比,链霉素(10μg/m L)处理后的PA-COP2的胞内转录发生了明显的改变,其中受群体感应(Quorum-sensing,QS)系统正调控的146个基因如中央调控基因las R和rhl R、参与绿脓菌素生物合成的关键基因(phz M和phz S)、mex GHI-opm D操纵子等的表达均被显著抑制。此外,与链霉素背景下单独培养的MRSA-COP112相比,在链霉素背景下PA-COP2草坪上生长的MRSA-COP112的胞内转录中共检测到1045个表达差异显著的基因,其中包括表达量升高的412个基因和表达量降低的633个基因,这些表达量升高的基因中有22个为铁获取相关基因。通过定量PCR进一步验证,发现经链霉素处理/未处理的PA-COP2的上清液刺激后,MRSA-COP112中具有铁捕获特性的基因的表达均显著增加。以上结果表明:链霉素能抑制PA-COP2的QS系统,并且PA-COP2的胞外产物能促进MRSA-COP112中铁摄取系统的表达。(5)以秀丽隐杆线虫为体内感染模型,检测了铜绿假单胞菌对MRSA-COP112毒力的影响。结果发现无论将铜绿假单胞菌模式菌株PAO1还是临床菌株PA-COP2的上清液加入到线虫生长平板中,MRSA-COP112对线虫的致死率均显著提高,并且PA-COP2上清液对MRSA-COP112毒力的增强作用强于PAO1。抗生素干预作为一种常见的传染病治疗方法,其作用机制已经得到了充分的研究,然而对于经抗生素处理后,病原菌胞内表达调控的变化及其对病原菌种间互作关系的影响仍知之甚少。本文以铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌为模型,鉴定了细菌病原菌之间由抗生素决定的相互入侵关系。与金黄色葡萄球菌相比,铜绿假单胞菌可以通过产生受QS系统调控的胞外毒素来提高其竞争优势,但MRSA-COP112在10μg/m L链霉素干预下却能够抑制邻近铜绿假单胞菌的生长。这是因为链霉素能抑制铜绿假单胞菌的QS系统,且铜绿假单胞菌的胞外产物可以增加MRSA-COP112的毒力和铁获取相关基因的表达,从而使得MRSA-COP112在链霉素背景下实现对邻近铜绿假单胞菌的生长抑制。因此,本课题为抗生素反复治疗过程中优势种的替代和病原菌在宿主内的持续共存提供了解释,这些问题的阐述与背后机制的揭示不仅有助于进一步丰富目前人们对于病原菌种间互作关系的认识,还有望为未来细菌性慢性感染疾病的精准诊治和抗感染药物研发提供新策略、新思路,具有显著的科学意义和临床价值。