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研究目的:心血管疾病是目前人类最为重要的死亡原因,在心肌梗死患者中,对于减少急性心肌缺血损伤、限制心肌梗死面积、维持左室收缩功能和预防心力衰竭及时有效的治疗方法则是心肌的血液再灌注。然而,再灌注这个过程本身可以进一步加剧心肌损害,该现象被称为心肌缺血再灌注损伤(MI/R)。我们目前已知的心血管疾病风险因素很多,如高血压、吸烟、肥胖、高血脂、糖尿病等。与非2型糖尿病患者相比,2型糖尿病患者心肌缺血再灌注后,心梗面积增加、心肌再灌注量减低、充血性心力衰竭发生率升高以及生存率降低。脂联素(Adiponectin,APN)是一种脂肪组织分泌的脂肪细胞因子,在肥胖和2型糖尿病患者中,血浆APN水平显著降低,导致心肌对MI/R损伤敏感性增加。微核糖核酸(micro ribonucleic acid,miRNA)是一种内源性单链非编码RNAs,长度在22个核苷酸左右。研究报道miRNA谱的改变与各种心血管疾病高度相关,如心肌梗死、心室重构、心肌病,且miRNA在糖尿病患者中的表达谱已经确定与疾病的诊断、进展、预后和治疗反应相关。为探究在糖尿病情况下,低脂联素血症加重心肌缺血再灌注损伤的机制,我们进行了深入研究。研究内容及方法:第一部分:利用野生型及APN基因敲除(APN-KO)小鼠建立MI/R模型,提取心肌组织miRNA进行芯片分析,筛选目的miRNA;第二部分:利用MI/R模型,予目的miRNA抑制剂与模仿体处理后,检测心功能、心梗面积、血浆CK-MB、凋亡水平以确定该miRNA对MI/R的调控作用;第三部分:对目的miRNA进行基因功能富集分析,对该通路进行RNA分布检测,结合预测软件筛选目的miRNA下游潜在靶基因并经荧光素酶报告基因检测确定。第四部分:利用乳鼠心肌细胞对目的miRNA及下游靶基因在高糖高脂(HGHL)及拟缺血再灌注(SI/R)下功能进行机制研究。第五部分:利用高脂喂养(HFD)诱导糖尿病小鼠建立MI/R模型,检测心功能、心肌梗死面积、CK-MB水平、心肌细胞损伤和凋亡水平等,验证目的miRNA及靶基因变化及作用,同时通过予小鼠APN治疗,确定其调控目的miRNA及下游基因从而起到心肌保护作用。研究结果:1.野生型及APN-KO小鼠心肌缺血再灌注后心肌miRNA表达谱筛选中,23个候选miRNA中miRNA-449b上调幅度最大(3.98倍),且可以被APN处理有效抑制高表达。2.miRNA-449b调控小鼠心肌缺血再灌注损伤;野生型小鼠中,过表达miRNA-449b后,MI/R损伤后心肌梗死面积及凋亡水平较单纯损伤组明显增加;APN-KO小鼠经抑制miRNA-449b表达后,MI/R损伤后心梗面积、血浆CK-MB及凋亡水平较单纯损伤组显著降低。3.Gene ontology(GO)分析示miRNA-449b功能富集于氧化应激反应,经APN-KO小鼠MI/R模型验证,miRNA-449b抑制剂可以有效减少MI/R后心肌组织内氧化应激的产生;mRNA array分析示Abl1、I16ra、Nfe211基因表达存在显著差异,经软件预测推断及在心肌细胞荧光素酶报告基因检测确定Nrf-1为miRNA 449b下游靶基因。4.miRNA-449b抑制高糖高脂下乳鼠心肌缺氧复氧后Nrf-1表达水平,超氧化物水平及凋亡增多;与单纯SI/R组相比,miRNA-449b抑制剂可以显著恢复SI/R后降低的Nrf-1表达,明显降低损伤后超氧化物含量,且Cleaved Caspase3水平及TUNEL结果示凋亡水平显著降低。与高糖高脂下单纯缺血缺氧组心肌细胞相比,过表达Nrf-1后,超氧化物生成显著减少。5.糖尿病小鼠心肌缺血再灌注损伤后,心肌miRNA-449b表达量显著增加,且在APN处理后被有效抑制表达;糖尿病小鼠中,与单纯心肌缺血再灌注损伤组相比,抑制miR449b表达小鼠MI/R后心功能显著改善,心肌梗死面积明显减小、血浆CK-MB及心肌超氧化物含量明显降低;糖尿病小鼠MI/R后Nrf-1表达降低,予APN后可以明显恢复且增加其表达量、超氧化物生成减少、Cleaved Caspase3表达降低。结论:在糖尿病情况下,APN水平降低,在心肌缺血再灌注损伤发生时,激发大量microRNA-449b表达,并直接结合靶基因Nrf-1,降低其心肌表达量,抑制其抗氧化作用导致超氧化物的生成蓄积,心肌细胞凋亡增多,最终导致心脏功能降低。与此同时,证明了 Adiponectin可能通过作用于microRNA-449b而调控Nrf-1表达,发挥对糖尿病心脏心肌缺血再灌注损伤后的心肌保护作用。