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羊毛是绵羊养殖业的主要副产品之一，也是牧民收入的重要经济来源之一。中国是畜牧业大国也是绵羊资源大国，羊毛产业是中国牧区经济重要的组成部分，有着至关重要的地位。作为纺织纤维中的天然材料，羊毛因其有多种优良特性在纺织业中具有不可代替的地位，优良的细毛（直径13~24μm）更是许多高端纺织品不可或缺的材料，但中国纺织所需羊毛2/3依靠进口，其中细毛的进口依赖性更大。中国绵羊养殖分布在东北、西北和内蒙古等多个省份，但是多以肉羊为主，细毛羊数量少，高档细毛产量低。中国美利奴羊是中国早期自主培育的细毛羊品种，但是品种资源单一，数量不足。因此，挖掘中国细毛绵羊品种的优良基因并提高中国羊毛质量和产量是提高牧民收入和提升养羊业科技含量的重大问题，具有重要的科学和经济意义。已有研究证明粗毛和细毛成分的差异之一在于高甘氨酸-酪氨酸蛋白（high-glycine-tyrosine KAPs,HGTPs）的含量和分布不同，研究还证明其基因多态性影响了羊毛弯曲度和细度性状调控基因的表达。绵羊HGTPs是一个多基因编码的角蛋白家族，其成员主要包括KAP6、KAP7和KAP8三种不同的角蛋白联合蛋白（Keratinassociated protein,KAP）。
鉴于此，本论文在前期对三个基因编码区多态性研究基础上，以三种绵羊（中国美利奴细毛羊、萨福克羊、湖羊）为主，采用PCR（Polymerase Chain Reaction,PCR）克隆、RACE（Rapid Amplification of cDNA Ends,RACE）克隆、测序和生物信息学分析等手段，主要比较分析了绵羊HGTP家族KAP6、KAP8基因启动子调控元件、上游调控区序列差异，从而了解KAP6、KAP8基因启动子区域在不同绵羊品种中的差异，为细毛羊育种提供一定的理论参考。结果总结如下：
（1）对步移法TAIL-PCR（thermal asymmetric interlaced PCR,TAIL-PCR）获得的KAP6、KAP7和KAP8基因上游序列进行验证及启动子预测
用中国美利奴羊、湖羊和山羊DNA样品对TAIL-PCR获得的KAP6、KAP7和KAP8上游克隆序列进行了拼接区域的片段扩增验证，证实了其获得序列的正确性并提交绵羊的三个序列并获得GenBank序列号MT084114、MT084115和MT090064。三种羊三个基因在近CDS（Coding sequence,CDS）区上游克隆序列结果均一致，说明KAP6、KAP7和KAP8角蛋白基因在近CDS区上游的400～500bp区间的序列片段在羊中可能有高度保守性，且与羊的品种无关。同时也对验证后的序列进行了初步的启动子预测分析，均在各序列中预测到启动子，综合评分预测KAP6、KAP7和KAP8基因启动子大约分别位于各自转录起始点上游-40～-1000bp、-800～-1500bp和-100～-900bp区间。同时也预测到了TATA盒以及AP1、TFIID、SRF、NF-KB、CREB、SP1等相关转录因子结合位点。
（2）KAP6和KAP8基因全长cDNA克隆及转录起始点确认
对KAP6和KAP8基因进行5′端RACE和3′端RACE克隆，测序拼接后得到了长度分别为606bp、559bp的三个基因全长cDNA序列，其CDS区序列长度分别为252bp和189bp，与NCBI公布的绵羊对应序列高度一致。在CDS区上游分别得到了5′UTR（Untranslated Region,UTR）区域，长度分别为43bp和50bp，并确定了两个基因的转录起始点及其在各自上游克隆序列中的具体位置和碱基。
（3）KAP6和KAP8上游区克隆及多态性分析
在对KAP6和KAP8基因上游启动子序列进行初步扩增（选取中国美利奴羊、湖羊、山羊作为实验材料）中，中国美利奴羊和湖羊的KAP6基因上游约1600bp长度的序列经过种间对比几乎一致，绵羊品种内差异很小。在KAP8基因扩增序列种间对比中，中国美利奴羊和湖羊相对于山羊有一段约7个碱基长度的片段插入多态性，同时中国美利奴羊和湖羊以及山羊都有一段不同长度的（CA）3重复碱基序列。
在对KAP6和KAP8基因启动子序列进行群体检测（选取中国美利奴羊、萨福克羊作为实验材料）中，KAP6基因总计得到37个完整序列（其中中国美利奴羊22个，萨福克羊15个，长度均在1000bp左右）。共发现7个SNP（single nucleotide polymorphism,SNP）多态性位点，所得结果中有7种单倍型，分别有两种单倍型只在单个羊品种内出现，属于品种特异性单倍型。KAP8基因总计得到32个完整序列（其中中国美利奴羊21个，萨福克羊11个，长度均在2500bp左右）。共发现74个SNP位点和片段插入-缺失突变位点，存在32种单倍型。在KAP8基因编码区上游扩增区域所得多态性中并未发现粗、细毛羊之间的物种特异性序列，综合品种特异单倍型和突变点挑选出12条代表序列分别作为中国美利奴羊、萨福克羊KAP6和KAP8基因代表序列。
（4）KAP6和KAP8上游调控序列生物信息学分析及种间对比
对中国美利奴羊和萨福克羊的KAP6和KAP8基因代表序列进行转录因子结合位点预测并进行种内及种间的对比分析，结果显示在KAP6基因预测位点种间对比中两个绵羊品种具有12个常见的转录因子结合位点。其次在萨福克羊KAP6基因上游区还发现该品种所特异性拥有的6个转录因子预测结合位点，分别为POU5F1、SMAD1、MBD3、TRIM28、POU2F1、CREBBP。其中MBD3和TRIM28为转录调节抑制因子，CREBBP对转录有增强作用。
同样，KAP8基因上游区也具有常见转录因子共有16个结合位点为两个品种共有。而KAP8基因在中国美利奴羊发现3个物种特异性结合位点，分别为CDK9、SMAD4和TRIM28，其中CDK9有稳定转录延伸作用，TRIM28有抑制作用。萨福克羊有10个物种特异性结合位点，分别为STAT3、USF1、SMAD3、STAT1、EP300、CREB1、ETV4、SIN3A、POLR3A，其中CREB1有增强转录的作用，SIN3A可能有转录抑制的作用。
基因的调控转录是一个非常复杂的过程，预测位点的对比分析为进一步研究KAP6和KAP8的基因调控机制及筛选特异性启动子提供了一定的理论参考。
鉴于此，本论文在前期对三个基因编码区多态性研究基础上，以三种绵羊（中国美利奴细毛羊、萨福克羊、湖羊）为主，采用PCR（Polymerase Chain Reaction,PCR）克隆、RACE（Rapid Amplification of cDNA Ends,RACE）克隆、测序和生物信息学分析等手段，主要比较分析了绵羊HGTP家族KAP6、KAP8基因启动子调控元件、上游调控区序列差异，从而了解KAP6、KAP8基因启动子区域在不同绵羊品种中的差异，为细毛羊育种提供一定的理论参考。结果总结如下：
（1）对步移法TAIL-PCR（thermal asymmetric interlaced PCR,TAIL-PCR）获得的KAP6、KAP7和KAP8基因上游序列进行验证及启动子预测
用中国美利奴羊、湖羊和山羊DNA样品对TAIL-PCR获得的KAP6、KAP7和KAP8上游克隆序列进行了拼接区域的片段扩增验证，证实了其获得序列的正确性并提交绵羊的三个序列并获得GenBank序列号MT084114、MT084115和MT090064。三种羊三个基因在近CDS（Coding sequence,CDS）区上游克隆序列结果均一致，说明KAP6、KAP7和KAP8角蛋白基因在近CDS区上游的400～500bp区间的序列片段在羊中可能有高度保守性，且与羊的品种无关。同时也对验证后的序列进行了初步的启动子预测分析，均在各序列中预测到启动子，综合评分预测KAP6、KAP7和KAP8基因启动子大约分别位于各自转录起始点上游-40～-1000bp、-800～-1500bp和-100～-900bp区间。同时也预测到了TATA盒以及AP1、TFIID、SRF、NF-KB、CREB、SP1等相关转录因子结合位点。
（2）KAP6和KAP8基因全长cDNA克隆及转录起始点确认
对KAP6和KAP8基因进行5′端RACE和3′端RACE克隆，测序拼接后得到了长度分别为606bp、559bp的三个基因全长cDNA序列，其CDS区序列长度分别为252bp和189bp，与NCBI公布的绵羊对应序列高度一致。在CDS区上游分别得到了5′UTR（Untranslated Region,UTR）区域，长度分别为43bp和50bp，并确定了两个基因的转录起始点及其在各自上游克隆序列中的具体位置和碱基。
（3）KAP6和KAP8上游区克隆及多态性分析
在对KAP6和KAP8基因上游启动子序列进行初步扩增（选取中国美利奴羊、湖羊、山羊作为实验材料）中，中国美利奴羊和湖羊的KAP6基因上游约1600bp长度的序列经过种间对比几乎一致，绵羊品种内差异很小。在KAP8基因扩增序列种间对比中，中国美利奴羊和湖羊相对于山羊有一段约7个碱基长度的片段插入多态性，同时中国美利奴羊和湖羊以及山羊都有一段不同长度的（CA）3重复碱基序列。
在对KAP6和KAP8基因启动子序列进行群体检测（选取中国美利奴羊、萨福克羊作为实验材料）中，KAP6基因总计得到37个完整序列（其中中国美利奴羊22个，萨福克羊15个，长度均在1000bp左右）。共发现7个SNP（single nucleotide polymorphism,SNP）多态性位点，所得结果中有7种单倍型，分别有两种单倍型只在单个羊品种内出现，属于品种特异性单倍型。KAP8基因总计得到32个完整序列（其中中国美利奴羊21个，萨福克羊11个，长度均在2500bp左右）。共发现74个SNP位点和片段插入-缺失突变位点，存在32种单倍型。在KAP8基因编码区上游扩增区域所得多态性中并未发现粗、细毛羊之间的物种特异性序列，综合品种特异单倍型和突变点挑选出12条代表序列分别作为中国美利奴羊、萨福克羊KAP6和KAP8基因代表序列。
（4）KAP6和KAP8上游调控序列生物信息学分析及种间对比
对中国美利奴羊和萨福克羊的KAP6和KAP8基因代表序列进行转录因子结合位点预测并进行种内及种间的对比分析，结果显示在KAP6基因预测位点种间对比中两个绵羊品种具有12个常见的转录因子结合位点。其次在萨福克羊KAP6基因上游区还发现该品种所特异性拥有的6个转录因子预测结合位点，分别为POU5F1、SMAD1、MBD3、TRIM28、POU2F1、CREBBP。其中MBD3和TRIM28为转录调节抑制因子，CREBBP对转录有增强作用。
同样，KAP8基因上游区也具有常见转录因子共有16个结合位点为两个品种共有。而KAP8基因在中国美利奴羊发现3个物种特异性结合位点，分别为CDK9、SMAD4和TRIM28，其中CDK9有稳定转录延伸作用，TRIM28有抑制作用。萨福克羊有10个物种特异性结合位点，分别为STAT3、USF1、SMAD3、STAT1、EP300、CREB1、ETV4、SIN3A、POLR3A，其中CREB1有增强转录的作用，SIN3A可能有转录抑制的作用。
基因的调控转录是一个非常复杂的过程，预测位点的对比分析为进一步研究KAP6和KAP8的基因调控机制及筛选特异性启动子提供了一定的理论参考。