目的：维生素E同系物是一类具有预凋亡活性的维生素E的衍生物，其中以α-生育酚琥珀酸酯(α-tocopheryl succinate，α-TOS)为代表。研究证明α-TOS能够引发多种肿瘤细胞凋亡，并且对恶性肿瘤细胞具有高度选择性而对正常细胞没有毒性，使之成为一种有前途的肿瘤预防及治疗药物。乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，其发病率占妇女肿瘤的31％，其中10％-34％属于erbB2表达乳腺癌。erbB2(HER-2/neu)为人类表皮生长因子受体家族成员之一，它参与抑制细胞凋亡，维持或促进肿瘤细胞生长。因此erbB2表达乳腺癌恶性程度较高。常规治疗乳腺癌的方法包括手术、化疗和内分泌治疗等，而erbB2表达的乳腺癌对许多化疗药物不敏感。erbB2基因的激活导致其下游的磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)和丝氨酸、苏氨酸蛋白激酶Akt的自动活化。Akt引起核转录因子κB(nucler factor-κB，NFκB)的激活，在大多数非恶性细胞中，NFκB复合体(通常由抑制亚单位IκB和p50以及p65亚基组成的异三聚体)主要位于细胞质中。NFκB的激活导致其易位进入细胞核并结合到某些特定基因的启动子区域，例如与IAP和FLIP基因的启动子区域结合，从而使肿瘤细胞能抵抗凋亡。因此，抑制erbB2表达乳腺癌细胞的NFκB活性的药物具有临床治疗意义。最近，发现α-TOS能够诱导erbB2表达的乳腺癌细胞的凋亡。所以本实验以人乳腺癌细胞系MCF-7(erbB2低表达)及MDA-MB-453(erbB2高表达)为模型，通过测定Akt的活性，NFκB p65的核移位，caspase的活性，以及经α-TOS处理后，MCF-7及MDA-MB-453细胞形态学变化，并测定α-TOS对MCF-7及MDA-MB-453细胞的半数抑制浓度即IC50值，研究α-TOS诱导erbB2表达乳腺癌细胞凋亡的分子机制，并探讨α-TOS是否通过NFκB信号途径诱导erbB2表达乳腺癌细胞的凋亡。　　方法：1细胞培养和处理人类乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-453培养在10％初生小牛血清-DMEM培养基中。细胞浓度达到50-70％汇合时，在细胞培养基中加入不同浓度的α-TOS。药物处理一定时间后，收集细胞进行实验。　　2 MTT检测 MCF-7和MDA-MB-453细胞分别接种于96孔培养板，贴壁后加入浓度不同的α-TOS继续培养24h和48h，每个剂量设6个复孔，处理时间结束后加入MTT5mg/ml，继续培养4小时，二甲基亚砜(DMSO)溶解结晶，用酶标仪在490nm波长下测定各孔OD值。通过SPSS软件进行数据分析，计算细胞半数抑制浓度(IC50)值，并以α-TOS浓度为横坐标，生长抑制率为纵坐标作图。　　细胞生长抑制率(％)=(对照组平均OD值-处理组平均OD值)/对照组平均OD值×100％　　3 Hoechst染色观察细胞凋亡形态取无菌盖玻片置于6孔板内，MCF-7细胞和MDA-MB-453细胞接种于6孔板内培养过夜，使约为70％汇合。加α-TOS刺激细胞发生凋亡后，吸尽培养液，加入0.5ml固定液，固定10分钟。去固定液，用PBS洗2次，每次3分钟，吸尽液体。加入0.5ml Hoechst33258染色液染色5分钟，去染色液，用PBS洗2遍，每次3分钟，吸尽液体。滴一滴抗荧光淬灭封片剂于载玻片上，盖上贴有细胞的盖玻片，让细胞接触封片液，尽量避免气泡。荧光显微镜观察染色结果，并拍照。　　4免疫印迹收集细胞，使用蛋白提取试剂提取细胞总蛋白。蛋白质样品变性后，使用10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后转移到硝酸纤维素膜。膜封闭后加入一抗孵育，然后进一步加入辣根过氧化物酶标记的二抗继续孵育。用β-actin或组蛋白1抗体作为蛋白质的加样对照。　　5 RT-PCR检测用Trizol试剂提取细胞中总RNA。使用AMV反转录酶，以oligo(dT)18为引物进行反转录。取一至三微升的cDNA用于扩增，PCR扩增运行30个循环。扩增c-IAP1的引物对为：上游引物：5-GAATACTCCCTGTGATTAATGGTGCCGTGG-3’，下游引物：5-TCTCTTGCTTGTAAAGACGTCTGTGTCTTC-3’，扩增产物的长度为230 bp；扩增FLIP的上游引物为：5-CATACTGAGATGCAAGAATT-3’，下游引物为：5-GCTGAAGTCATCCATGAGGT-3，扩增产物的长度为875　　bp；扩增β-actin的上游引物为：5-TGACGCJGGTCACCCACACTGTGCC-3’，下游引物为：5-CTAGAAGCATTTGCGGTGGACGATGGAGGG-3’，扩增产物的长度为662 bp。用于PCR扩增的条件如下：94℃30秒，65℃30秒，72℃1分钟，在25μl反应体系共30个循环。　　6 caspase3和caspase8活性测定通过裂解酶底物显色来测定caspase3和caspase8的活性，所用底物分别为Ac-DEVD-pNA(acetyl-Asp-Glu-Val-Asp p-nitroanilide)和 Ac-IETD-pNA(aeetyl-Ile-Glu-Thr-Asp p-nitroanilide)。大约30μg总蛋白加入含Ac-DEVD-pNA(2 mmol/L)或Ac-IETD-pNA(2 mmol/L)反应缓冲液，并在37℃孵育2h。使用分光光度计测定从相应底物分裂的黄色pNA在405nm的吸光度值。　　7免疫细胞化学 MCF-7细胞和MDA-MB-453细胞接种在12孔板中的无菌盖玻片上，过夜，用100％甲醇固定3分钟，含1％过氧化氢的甲醇处理5分钟，95％和50％甲醇分别固定3分钟。然后细胞先后与抗p65抗体、生物素标记的二抗反应。用PBS洗涤后，细胞在HRP-抗生物素蛋白链菌素中孵育。最后，采用DAB显色检测蛋白表达，在显微镜下观察结果。　　8统计每个实验至少重复三次，获得结果以X-SD表达。使用t检验进行显著性检验，在p<0.05时被认为有显著统计学差异。　　结果：1α-TOS对MCF-7和MDA-MB-453细胞的IC50值　　以α-TOS浓度为横坐标，抑制率为纵坐标作图。不同浓度α-TOS对乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-453细胞均具有显著的生长抑制作用(p<0.05)，表现为剂量时间依赖关系。用SPSS软件求出α-TOS对MCF-7细胞的IC50值分别为：24小时111.72μg/ml，48小时44.29μg/ml；α-TOS对MDA-MB-453细胞的IC50值分别为：24小时113.23μg/ml，48小时47.20μg/ml。　　2α-TOS诱导MCF-7和MDA-MB-453细胞凋亡　　α-TOS作用于MCF-7和MDA-MB-453细胞48小时后，经Hoechst染色结果显示，对照组细胞核形态规则，染色均匀。而100μmol/ml的α-TOS处理组细胞核固缩或碎裂。　　3α-TOS抑制erbB2表达的乳腺癌细胞NFκB的核转位　　3.1免疫印迹我们检测到MDA-MB-453和MCF-7细胞均表达erbB2和磷酸化Akt(p-Akt)和相似水平的Akt。经α-TOS处理两个细胞系后，p65蛋白在细胞核中表达下降，在细胞质中的表达增加。　　3.2免疫组化用100μmol/Lα-TOS处理MDA-MB-453和MCF-7(数据未显示)细胞，结果表明，p65蛋白(NFκB亚基)在核中的表达减少。　　4α-TOS抑制Akt的活化　　α-TOS处理MCF-7和MDA-MB-453细胞不同时间后提取总蛋白，使用免疫印迹检测Akt，p-Akt和β-actin的表达量。p-Akt在MCF-7和MDA-MB-453细胞中表达水平下降，而总的Akt在这两种细胞株中的表达水平没有改变。　　5α-TOS抑制erbB2表达乳腺癌细胞中c-IAP1和FLIP的表达　　5.1α-TOS对erbB2表达乳腺癌细胞中c-IAP1和FLIP mRNA表达的影响 RT-PCR检测结果表明，α-TOS以剂量和时间依赖的方式降低MDA-MB-453和MCF7细胞的c-IAP1 mRNA的量；MDA-MB-453和MCF7细胞经α-TOS处理后，FLIP mRNA的量降低。　　5.2α-TOS对erbB2表达乳腺癌细胞中c-IAP1和FLIP蛋白表达的影响免疫印迹结果表明，经α-TOS处理后，α-TOS降低这两个细胞株的c-IAP1蛋白和FLIP蛋白的表达。　　6α-TOS增强caspase的活性　　我们的实验结果证实MCF-7细胞不表达caspase3，α-TOS诱导MCF-7细胞的caspase8的活性增加；α-TOS增加MDA-MB-453细胞中caspase3和caspase8的活性。　　结论：1α-TOS抑制MCF-7和MDA-MB-453细胞的生长。　　2α-TOS诱导MCF-7和MDA-MB-453细胞凋亡。　　3α-TOS通过NFκB信号途径诱导erbB2阳性的乳腺癌细胞凋亡。