研究背景胆管癌（Cholangiocarcinoma,CCA）是起源于胆管的高度恶性肿瘤。根据CCA的解剖位置和治疗方案,CCA可进一步分为三种亚型,即肝内胆管癌（intrahepatic cholangiocarcinoma,iCCA）、肝 门 部 胆 管 癌（perihilar cholangiocarcinoma,pCCA）和远端胆管癌（distal cholangiocarcinoma,dCCA）。CCA的这些亚型具有各自独特的危险因素,分子发病机制,治疗选择和预后。pCCA起源于二级胆管至胆囊管与胆总管的汇合点,占CCA病例的50%以上。外科手术是肝门部胆管癌的首选治疗方案;然而,由于肝门胆管癌进展迅速,加之肝门部解剖结构复杂,根治性切除pCCA非常困难。而且多数患者出现的黄疸预示着根治性切除的手术时机已晚。一般来说,对于晚期或不能切除的CCA患者,其中位总生存期往往不足1年。即使在根治性切除术后,5年总生存率也不到30%。实际上,放射疗法和化学疗法对pCCA的作用也是有限的。而且,在这个精确治疗的时代,pCCA的研究更远远落后于其他如肺癌和结肠癌等更常见的肿瘤。究其原因,可能有:（i）pCCA的总体患病率相对较低,难以建立一个大的研究队列;（ii）pCCA由于其特殊的解剖位置很难获得标本,导致pCCA相关的高通量实验报道很少;（iii）大多数诊断患者已失去手术机会,生存时间短,无法进行任何实验性治疗。因此,有必要进一步研究pCCA的发病机制和治疗方法。靶向治疗和精确治疗是基于一些有效的生物标志物和对肿瘤进展的更加深入地理解而涌现出的新兴的治疗方式。然而,由于取材困难和难以建立大型队列,这些方式对于pCCA的治疗是极其困难的。即使在很少一部分患者可以接受外科手术切除的情况下,根治性切除率也很低。这增加了手术治疗的异质性,并导致难以收集同质队列来验证生物标记物或进行治疗。根据我们的经验,我们组建了一组接受根治性切除术的pCCA患者（106例）,并进一步证实了 pCCA的几种潜在的生物标志物。然而,想要准确地预测pCCA患者的术后风险并指导患者的个体化治疗,需要更多的与pCCA预后相关的生物标志物。高迁移率族A1（High mobility group A1,HMGA1）蛋白是一种作为结构性转录因子的小核蛋白。在正常条件下,HMGA1在胚胎发生过程中、正常胚胎干细胞和成体干细胞中均可高表达,在成熟分化组织中几乎检测不到HMGA1;然而,癌症中的一些异位事件,如致癌转录因子、表观遗传学改变和染色体易位事件,可以诱导HMGA1异常上调。HMGA1的异位表达已在多种不同的肿瘤中被广泛报道。而且,HMGA1的过度表达与胰腺癌、肝细胞癌等多种癌症的进展或不良预后相关。此外,HMGA1已被证明可以激活一些参与肿瘤发生、增殖、迁移、侵袭和上皮间充质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）的多种基因。在iCCA中过度表达的HMGA1可增强肿瘤的致瘤性。然而,HMGA1在pCCA中的临床意义尚未阐明。染色体数目或非整倍性的改变也是高度恶性瘤形成的特征,这是由于有丝分裂检查点在有丝分裂期间对染色体分离的控制缺陷造成的。准确的染色体分离对于避免染色体非整倍体是至关重要的。染色体非整倍体是人类恶性肿瘤的一个共同特征,约占人类实体肿瘤的90%和造血肿瘤的50%以上。作为染色体分离的关键调节因子,甲状腺激素受体相互作用因子13（Thyroid hormone receptor interactor 13,TRIP13）在多种成人正常组织中表达,并在有丝分裂检查点复合体（Mitotic checkpoint complex,MCC）失活中发挥关键作用。TRIP13是多种癌症中的一种癌基因蛋白,并在包括头颈癌、肝细胞癌、结直肠癌、乳腺癌等多种人类肿瘤中异常表达。作为MCC失活的一种关键蛋白,TRIP13主要通过改变末端大分子的构象来促进肿瘤进展。TRIP13在非恶性细胞中的过度表达可增加细胞的致瘤性;然而,TRIP13在pCCA中的作用仍尚不清楚。在我们的这项研究中,我们评估了 HMGA1在一个大的pCCA队列中的表达及其临床意义,并研究了 HMGA1的致癌功能。通过体外和体内实验以及生物信息学研究,我们确定TRIP13是HMGA1诱导pCCA细胞干性、上皮间质化和转移活性的关键蛋白。此外,我们还进一步研究了 HMGA1-TRIP13轴如何促进pCCA进展的潜在机制,并证明HMGA1-TRIP13轴具有依赖于c-Myc参与的正反馈回路。第一部分HMGA1与肝门胆管癌的不良预后有关并促进肝门胆管癌的进展目的:胆管癌是一种起源于胆管上皮的高度恶性的消化系统肿瘤。肝门部胆管癌（pCCA）发生于肝内二级胆管至胆囊管与胆总管汇合处,是胆管癌（CCA）三种亚型中最常见的类型。过度表达的HMGA1可增强肝内胆管癌（intrahepatic cholangiocarcinoma,iCCA）的致瘤性。然而,HMGA1 在 pCCA中的临床意义尚未阐明。在本部分的研究中,我们将通过分析HMGA1在pCCA中的表达,明确HMGA1与pCCA患者临床病理特征和预后的关系。并通过研究HMGA1对pCCA细胞株不同功能的影响,探讨HMGA1对pCCA的致癌作用。方法:我们首先收集了 325例在山东大学齐鲁医院诊断为pCCA并于2013年至2018年接受手术切除的患者信息。根据一定的纳入标准,从主要队列中进一步选择106例接受根治性手术切除的pCCA患者作为本次研究的验证队列。8对pCCA组织及相邻的正常组织的转录组测序谱用于鉴定pCCA中差异表达的基因。分析HMG家族各成员在转录组测序谱中的表达。收集pCCA患者的癌组织及相邻的正常组织,通过qRT-PCR检测HMGA1在pCCA及相应邻近组织中的表达。免疫蛋白印迹法检测新鲜pCCA组织及对应的邻近正常组织中HMGA1的表达。应用免疫组织化学方法检测106例pCCA患者组织中HMGA1的表达情况。采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线,采用log-rank检验进行患者生存率差异的比较。采用单因素和多因素分析,研究HMGA1与pCCA患者临床病理情况的关系,探究HMGA1的临床意义。在不同胆管上皮细胞系HIBEpiC、QBC-939、FRH-0201、RBE和HCCC-9810以及胆囊癌细胞系GBC-SD、NOZ和SGC-996中检测HMGA1表达含量。分别用shRNAs沉默HMGA1,用携带LV-GV492-HMGA1的慢病毒过表达 HMGA1。应用 QBC-939（sh-HMGA1）和 FRH-0201（GV492-HMGA1）细胞系评估HMGA1对体外细胞增殖、侵袭和迁移的影响。建立QBC-939（sh-HMGA1）和FRH-0201（GV492-HMGA1）稳定的细胞系,并注射到裸鼠皮下成瘤。我们进一步研究了 QBC-939（sh-HMGA1、GV492-HMGA1）细胞 3D 成球实验以及 QBC-939（sh-HMGA1）和 FRH-0201（GV492-HMGA1）中上皮间充质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）标志物的表达情况。结果:在HMG家族中,与邻近胆管组织相比,pCCA中只有HMGA1显著上调。用应用免疫组化的方法检测pCCA患者肿瘤组织中HMGA1的表达情况,提示HMGA1可能是pCCA的预后生物标志物。在多因素分析中,证实HMGA1是pCCA的独立预后生物标志物。通过体外实验,我们验证了 HMGA1能够促进pCCA细胞系的增殖,侵袭,转移,3D成球和EMT。裸鼠皮下成瘤实验也进一步验证了HMGA1的在体内的促进肿瘤增殖作用。结论:高迁移率蛋白HMGA1在pCCA中表达较高,并且HMGA1是pCCA的独立预后生物标志物。HMGA1能够促进pCCA细胞系的增殖,侵袭,转移,干性和EMT。这为肝门部胆管癌的分子靶向治疗提供了新的研究思路。第二部分HMGA1通过促进TRIP13的转录和表达诱导肝门胆管癌的进展目的:在上一部分研究中,我们发现高迁移率蛋白HMGA1是影响pCCA预后的不良生物学标志物。但是HMGA1在pCCA中作用的下游靶点尚不清晰。在之前的研究中,在HMGA1调控的多个因子中,包括甲状腺激素受体相互作用子13（Thyroid hormone receptor interactor 13,TRIP13）在内的 3 个因子被证实可以促进乳腺癌的进展。我们推测HMGA1也可能通过调控一些因子来影响pCCA的细胞功能,进而影响pCCA患者的预后。在这一部分中,我们的目的是探究HMGA1的下游靶因子,及其对pCCA的影响和作用机制。方法:将8对pCCA组织及相邻正常组织的转录组测序中的上调基因进行热图和层次聚类分析。并与之前研究中受HMGA1调控的蛋白因子进行比对。应用肿瘤基因组图谱TCGA数据库中胆管癌患者的mRNA表达情况,分析LRRC59/KIFC1/TRIP13与HMGA1 mRNA水平的相关性。并通过调控HMGA1的表达,检测三者mRNA的表达变化。对新鲜pCCA组织中进行HMGA1与TRIP13 mRNA的相关性研究。应用免疫组织化学方法检测106例pCCA患者组织中TRIP13的表达,分为低表达和高表达。我们进一步检测HMGA1与TRIP13之间的相关性。我们检测了 TRIP13在不同胆道系统细胞系中的表达情况。收集pCCA患者的癌组织及相邻的正常组织,通过qRT-PCR检测TRIP13在pCCA及相应邻近组织中的表达。免疫蛋白印迹法检测新鲜pCCA组织及对应的邻近正常组织中TRIP13的表达。采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线,采用log-rank检验进行患者生存率差异的比较。采用单因素和多因素分析,研究TRIP13与pCCA患者临床病理情况的关系,探究TRIP13的临床意义。通过pCCA细胞系的体外实验,我们研究了 TRIP13对pCCA细胞系的增殖、侵袭、迁移、细胞3D成球实验以及EMT标志物表达的影响。通过体外、体内实验,我们进一步探究了 TRIP13在HMGA1在促进pCCA进展中的作用。结果:TRIP13是在pCCA中受HMGA1调控的下游因子。其在pCCA中呈高表达,并与HMGA1的表达成正相关。用应用免疫组化的方法检测pCCA患者肿瘤组织中TRIP13的表达情况,提示TRIP13可能是pCCA的预后生物标志物。在多因素分析中,证实TRIP13是pCCA的独立预后生物标志物。TRIP13和HMGA1的双阳性表达是比TRIP13和HMGA1更敏感的预后生物标志物。通过体外实验,我们验证了 TRIP13能够促进pCCA细胞系的增殖,侵袭,转移,3D成球和EMT。在体外、体内实验中证实,在HMGA1诱导的肝pCCA进展中需要TRIP13。结论:TRIP13是HMGA1在pCCA中的下游细胞因子,并与HMGA1的表达成正相关。TRIP13和HMGA1的双阳性表达是比TRIP13和HMGA1更敏感的预后生物标志物。TRIP13能够促进pCCA细胞系的增殖,侵袭,转移,干性和EMT。在HMGA1诱导的pCCA进展中需要TRIP13。第三部分HMGA1-TRIP13轴在依赖c-Myc的正反馈回路中促进肝门胆管癌的干性和上皮间质转化目的:在我们之前的研究中,F-框/WD重复域蛋白7（F-box and WD repeat domain containing protein 7,FBXW7）可以抑制 CCA 的干性和 EMT。最近的一项研究表明,在胶质母细胞瘤中,FBXW7的表达被TRIP13抑制。但是FBXW7和TRIP13在pCCA进展中的相关性尚未明确。c-Myc是一种众所周知的与干细胞相关的癌蛋白,也是FBXW7泛素化的靶点。我们之前报道过c-Myc可以促进pCCA的进展。我们推测,TRIP13可能通过FBXW7影响c-Myc的表达,参与pCCA的干性和EMT,从而影响pCCA患者的预后。在这一部分中,我们的目的是探究pCCA中FBXW7在TRIP13促进pCCA进展中的作用。探讨HMGA1-TRIP13-c-Myc在pCCA中的相互关系,以及影响pCCA的机制。方法:我们首先用免疫蛋白印迹法和双荧光素酶法检测TRIP13和FBXW7在pCCA细胞系QBC-939、FRH-0201中表达的相关性。qRT-PCR检测HMGA1沉默/过度表达异种移植物中的TRIP13和FBXW7 mRNA水平。研究沉默TRIP13和/或FBXW7对pCCA细胞的增殖、侵袭、迁移、干性及EMT的影响。通过沉默TRIP13和/或FBXW7,检测c-Myc在蛋白质及mRNA水平的变化,以及泛素化抑制剂MG132对c-Myc基因表达的变化。通过c-Myc抑制剂和沉默c-Myc,检测HMGA1和TRIP13的基因表达及转录水平的变化。免疫蛋白印迹法检测沉默HMGA1或TRIP13后,HMGA1和TRIP13在不同时间段的表达情况。我们进一步研究了在c-Myc激活剂、c-Myc抑制剂、TRIP13抑制剂和HMGA1抑制剂存在的情况下,c-Myc、HMGA1和TRIP13的表达,以及对pCCA细胞的干性、EMT、迁移和侵袭的影响。结果:TRIP13可分别抑制FBXW7在QBC-939和FRH-0201细胞中的表达和转录。沉默TRIP13抑制pCCA增殖,敲除FBXW7则相反。沉默FBXW7促进迁移和侵袭,TRIP13敲除降低了上述作用。TRIP13基因敲除减弱了敲除FBXW7对pCCA细胞的增殖、迁移、侵袭干性及EMT的影响。FBXW7和TRIP13基因敲除对c-Myc的表达有调节作用,但对c-Myc的mRNA表达影响不大。FBXW7基因敲除可降低c-Myc的泛素化。c-Myc抑制剂和c-Myc基因敲除均可降低pCCA细胞中HMGA1和TRIP13的表达。而且,c-Myc促进QBC-939细胞TRIP13和HMGA1的转录。c-Myc、TRIP13和HMGA1的抑制剂均能抑制c-Myc、TRIP13和HMGA1的表达,并降低了 pCCA细胞的干细胞数,减弱了 pCCA细胞的EMT及在Wnt3a刺激下pCCA细胞的迁移和侵袭。结论:FBXW7抑制TRIP13诱导的pCCA细胞的干性和EMT。HMGA1-TRIP13轴在依赖c-Myc的正反馈回路中促进pCCA细胞的侵袭、干细胞和EMT。HMGA1、TRIP13或c-Myc的抑制剂可以阻断它们的反馈并抑制pCCA的进展。HMGA1-TRIP13-c-Myc之间的联系可能是治疗pCCA的一种很有前途的方法。