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革兰氏阳性放线菌糖多孢红霉菌(Saccharopolyspora erythraefa)所产生的次级代谢产物红霉素(Erythromycin,Er)是一类具有广谱抗菌效果的大环内酯类抗生素。自1952年发现以来红霉素及其衍生物药品已经发展到第三代,现在正在推向市场的第三代红霉素-酮内酯类抗生素(ketolide),不仅可以增强红霉素的酸稳定性,而且对许多耐药菌也具有杀死或抑制作用,被认为是下一代治疗耐药菌的抗生素。多年来,红霉素类药物一直是我国临床上主导的抗感染药物之一,以往对红霉素合成的研究主要集中在对红霉素合成途径和对红霉素本身的改造上。近年来Rodriguez及Lum两个研究组的研究均表明,红霉素高产菌株与低产菌株的主要差异在于红霉素合成的调控阶段,引起了越来越多的人对糖多孢红霉菌次级代谢调控基因的研究。但是由于在糖多孢红霉菌红霉素合成基因簇中缺少调控基因,所以限制了对糖多孢红霉菌次级代谢调控基因的寻找。迄今为止,在糖多孢红霉菌中除了调控子BldD(SACE2077)以外,对糖多孢红霉菌调控红霉素产量的调控基因少有报道。随着红霉素类药物市场需求量的增加,对红霉素高产菌株的需求也越来越强烈,获得红霉素高产菌株对满足其临床需要及工业生产具有重要的意义。本研究通过片段同源重组技术敲除了SACE7301基因构建了ΔSACE7301突变体。首先我们利用Sac.erythraea A226基因组为模板,通过PCR技术分别获得SACE7301基因两侧约1500 bp的上下游同源序列,并将其分别利用EcoRI/KpnI和XbaI/HindⅢ酶切,然后插入到质粒pUCTSR硫链丝菌肽抗性基因tsr两侧相应的酶切位点中,得到质粒pUCTSRA7301;然后通过线性片段同源重组技术用硫链丝菌肽抗性基因tsr将SACE7301基因替换从而构建出ΔSACE7301突变体。将ΔSACE7301突变株和A226、ΔbldD同时接到R3M大斜面上,30℃恒温培养箱中培养并观察孢子的生长情况,结果对比显示ΔSACE7301与A226的孢子生长情况基本没变化。同时,将ΔSACE7301与A226、ΔbldD分别接种到TSB液体培养基中30℃恒温发酵培养6天,通过抑菌活性初步分析红霉素产量变化,发现ΔSACE7301发酵液的红霉素产量比A226明显降低。抑菌结果初步显示SACE7301基因可能是参与红霉素生物产量的调控基因,但对孢子情况的观察表明SACE7301基因对糖多孢红霉菌的形态分化影响不大。为了进一步证明SACE7301的作用,将ΔSACE7301突变株与A226在R5发酵培养基中30℃培养6天,将发酵液萃取后,HPLC分析结果显示和前述基本一致,ΔSACE7301的红霉素A的产量比A226的红霉素A的产量降低了34.5%。为了排除红霉素产量的降低是由于随机在其它位点插入而引起的,我们对ΔSACE7301突变体进行了回复实验,将SACE7301基因通过穿梭质粒pZMW引入到ΔSACE7301突变体中,空载体pZMW作为对照,得到回复菌株ΔSACE7301/pZMW7301和对照ΔSACE7301/pZMW,ΔSACE7301/pZMW7301的红霉素A产量回复到A226的水平84.17%与对照相比提高152.09%,证明ΔSACE7301突变体中红霉素A产量的降低是由于SACE7301基因的缺失引起的。为了进一步证明SACE7301基因对红霉素A产量起到正调控的作用,将SACE7301基因导入到出A226中,构建了过表达菌株A226/ZMW7301。HPLC分析发酵液显示A226/pZMW7301的红霉素A产量比A226/pZMW升高了 23.1%,通过SACE7301基因的缺失,回复和过表达实验证明SACE7301对红霉素产量其正调控作用。为了验证SACE7301是否直接调控红霉素的合成,我们表达纯化了His6-SACE7301蛋白,然后将纯化的该蛋白和eryAI启动子温育其中加入PolydI/dC作为竞争核苷酸。EMSA发现eryAI启动子发生了明显的滞后现象,同时,我们用已知可以和eryA/启动子结合的BldD蛋白做了对照实验,发现SACE7301蛋白与对照实验现象类似,说明SACE7301蛋白在体外可以与eryAI启动子结合。本研究鉴定出糖多孢红霉菌中TetR家族转录调控子SACE7301正调控红霉素产量,但对糖多孢红霉菌的形态分化影响不大。并通过EMSA体外结合实验发现SACE7301蛋白在体外可以与eryAI启动子结合,推测出可能SACE7301作为正调控子直接调控红霉素的合成。本研究为红霉素生物合成调控机制提供了新的视野,并且为利用基因工程提高红霉素产量提供了理论依据。