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研究背景与目的:在癌症类型中,肺癌是目前全世界发病率和死亡率最高的恶性肿瘤。在我国,肺癌同样是威胁人民身体健康的最主要癌症,仅在2015年我国新增的肺癌病例就约733300例,其中男性约为509300例,女性224000例。肺癌可分为小细胞肺癌（small cell lung cancer,SCLC）和非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）,这种分型是根据细胞来源的不同来分的,其中非小细胞肺癌是最常见病理类型,约占全部肺癌的87%。非小细胞肺癌又分为大细胞肺癌、鳞癌和腺癌,而腺癌是非小细胞肺癌最常见病理类型,临床上早期肺癌大多无症状或轻度咳嗽、咳痰,大约有高达50%的患者在确诊肺癌时已发生多处转移,这时患者大多已不能耐受手术治疗。近年来,虽然各种诊断、治疗技术均有大幅度的提高,但肺癌的五年生存率仍然未得到显著提高,仅为16%左右。尽管肿瘤治疗方法的不断改进,已发生远处转移的晚期肺癌患者中位生存时间仅1年左右。肿瘤的骨转移是一个复杂的过程,肿瘤细胞定植到骨微环境中,通过与骨微环境的相互作用,影响成骨/破骨的动态平衡,实现肿瘤在骨组织中的增殖和侵袭。COL5A1（V型胶原α1链）,胶原蛋白家族蛋白,参与细胞外基质的形成。据报道,COl5A1在头颈部鳞状细胞癌、口腔鳞状细胞癌、胃癌、乳腺癌和卵巢癌等多种肿瘤中高表达,并与肿瘤的增殖及侵袭有关,可能参与肿瘤细胞的骨转移过程。通过对GEO数据库的芯片分析,我们初步发现COL5A1在肺癌组织中表达升高,并与肿瘤的进展存在相关性。目前,关于COL5A1在肺癌中的研究尚未见报道,其在肺癌中的作用和机制仍不清楚。研究目的:分析COL5A1与肺腺癌进展的相关性,明确COL5A1对肺腺癌细胞恶性生物学行为的影响,探索COL5A1影响肺腺癌细胞骨转移的分子机制,为肺癌的基础研究及寻找新的治疗方法提供理论依据。研究方法:1.首先,我们利用GEO数据库获取大量芯片数据,分析COL5A1与肺腺癌的发生及其进展的相关性。同时我们收集了在我院进行手术的肺腺癌患者瘤旁肺组织样本及肺腺癌原发灶样本各141例、肺腺癌骨转移灶样本42例,并通过q RT-PCR和IHC染色检测COL5A1在瘤旁肺组织、肺腺癌原发灶、肺腺癌骨转移灶间的表达差异,通过统计IHC染色结果、COL5A1表达水平与肺腺癌患者预后的相关性。2.随后,我们在肺腺癌细胞系H2126和H2009细胞系中敲减COL5A1或过表达COL5A1,并通过MTS实验、Transwell实验、流式细胞学分析了COL5A1对肺腺癌细胞增殖、迁移及凋亡等恶性生物学行为的影响,并进一步通过构建了敲减COL5A1的稳转细胞株,在体水平检测COL5A1对肺腺癌细胞系成瘤能力的影响;同时,我们利用干扰COL5A1表达的H2126和H2009细胞的条件性培养基刺激小鼠骨髓巨噬细胞（bone marrow macrophage,BMM）,检测干预COL5A1后的条件性培养基对BMMs破骨分化的影响。3.最后,我们利用敲减COL5A1的稳转细胞株进行与对照细胞进行转录组测序分析,通过GO分析和KEGG分析探索可能的下游通路,并通过western blot及q RT-PCR验证了COL5A1可能的下游通路。研究结果:1.根据数据库芯片分析,我们发现COL5A1与肺腺癌的发生及进展成明显相关性;利用组织样本统计分析,我们进一步明确了COL5A1在肺腺癌组织中的表达高于正常肺组织,同时COL5A1在骨转移灶中的表达又显著高于原发灶;COL5A高表达的肺腺癌患者临床预后较低表达的患者明显更差。2.干预CH2126和H2009细胞中COL5A1的表达,发现过表达COL5A1可促进H2126和H2009细胞的迁移、侵袭和增殖能力,抑制COL5A1可抑制H2126和H2009细胞的迁移、侵袭、细胞周期及增殖活性;并且在体实验证实,抑制COL5A1的表达可以抑制H2126细胞的成瘤能力。通过干预COL5A1表达的条件性培养基刺激BMMs细胞后,我们发现过表达COL5A1的条件性培养基可以促进BMMs细胞向破骨细胞的分化,而抑制COL5A1表达的条件性培养基抑制BMMs细胞向破骨细胞的分化。3.表达谱测序分析COL5A1在肺腺癌组织中显著高表达,同时,肺腺癌的进展也与COL5A1的表达存在显著的相关性。我们通过GO通路分析,发现抑制COL5A1后表达差异的基因在肿瘤发生和转移相关功能中存在一定程度的富集,通过KEGG信号通路分析,我们发现抑制COL5A1后表达变化的基因在PI3K-Akt通路中存在一定程度的富集,并且通过western blot及q RT-PCR验证了COL5A1可能通过激活PI3K通路从而抑制TIMP1的表达,并进而促进MMP2和MMP9的表达。通过对TCGA肿瘤数据库的分析发现COL5A1在肺腺癌样本中与MMP2和MMP9存在显著的共表达关系。结论:基于以上研究结果,我们认为COL5A1可能在肺腺癌转移特别是骨转移过程中发挥重要作用,COL5A1可以诱导肺腺癌细胞的增殖和迁移能力,并可促进肺腺癌细胞诱导的破骨细胞分化发挥作用,COL5A1通过与PI3K-AKT-TIMP1-MMP2/MMP9形成调控轴,促进肺腺癌细胞的增殖、迁移及骨转移的发生。