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流行性感冒是一种由流感病毒引起的传染病。流感病毒分为甲、乙、丙、丁四型，其中乙型流感病毒（IBV）基于HA抗原的不同可被分为Victoria型和Yamagata型。据WHO报告显示每年流感会感染世界5-10%人口，发病人口在300-500万人，导致29-60万人死亡。在季节性流行期间，IBV与IAV毒株每年会共同传播，而IBV可在流感季节占主导地位，IBV的患病人数可达23%-29%甚至更多；尤其是在7岁至17岁的儿童和青少年会导致严重疾病和并发症，据美国CDC报告显示在2004-2011年间，不包括2009年的大流感，由于感染IBV，儿童的死亡率达到了34%。在过去的几十年间，IBV在全球范围内的爆发程度和发病率逐渐上升，所造成的危害和经济损失已经超过了感染A/H1N1。随着针对IBV的抗病毒药物的耐药性，疫苗免疫已经成为了流感防治的重点和预防IBV的最有效的手段，但现阶段上市流感疫苗对于IBV的流行毒株的不匹配和低覆盖性，开发一种安全有效的IBV疫苗十分必要。
作为流感病毒感染过程的重要功能蛋白，HA一直是科研工作的研究热点。流感病毒HA蛋白具有由3条糖蛋白肽链组成三聚体结构，具有球状的HA1头部结构域与茎杆状的HA2茎部结构域组。其中HA1可以与宿主表面受体唾液酸受体结合，经内吞作用后，HA2在低pH（5-6）条件作用下，发生构象变化，使细胞膜与病毒膜之间的距离逐渐拉近并促进细胞膜与病毒膜融合，膜融合之后HA2隐藏的流感表位会短暂暴露在外并被免疫系统所识别，诱导免疫应答。HA1头部区的氨基酸序列具有高频突变性，极易发生抗原漂移，因此针对于HA1头部区进行疫苗设计是难点之一。HA2茎部区结构相对保守，但是由于感染过程中相对暴露时间短，而且免疫原性差，免疫应答较弱，也是疫苗设计的难点。构建基于HA三聚体结构的重组蛋白，模拟流感病毒感染时的天然构象一直是研究的热点。同时随着针对HA2广谱中和抗体的发现，利用HA2全长或HA2保守区表位作为免疫原诱导广谱中和抗体的方式得了关注。
本课题组龚鑫等人在前期的工组中，筛选出了三条基于HA2的较短的优势表位，发现以诺如病毒P颗粒作为抗原递呈载体，搭载三条优势表位经原核表达免疫动物之后，得到了具有中和活性的抗体，该免疫原可以诱导针对HA2茎部区抗体，阻止HA2结构变化，抑制膜融合。其重组蛋白免疫血清能够针对H3亚型流感病毒具有较好的中和活性；同时针对IBV亚型流感病毒具有一定的中和能力，展示了所筛选的针对于IBV序列的潜在有效性和可能性。由于诺如病毒在人体中可能存在预存免疫，同时为了设计出能够诱导针对IBV的HA2茎部区的中和抗体，本课题重新进行表位筛选、优化和设计，选择新的抗原递呈平台进行实验，期望能够获得针对IBV的HA2的广谱中和抗体。
研究表明铁蛋白（Ferritin）可以自组装形成直径为12nm的24聚体，其N端可以插入外源基因，在插入HA蛋白后可以使蛋白形成三聚体构象。且Ferritin蛋白已经被广泛应用于艾滋病毒和流感病毒的疫苗研究中。
基于上述分析，本课题希望以幽门螺杆菌的Ferritin作为抗原递呈载体搭载我们筛选和预测的保守表位，采用原核体系中表达纯化，表征和免疫后，期望获得针对IBV的HA2的广谱中和抗体。
我们分析了4022株的B型的HA蛋白序列，将筛选的保守序列以多拷贝串联和单拷贝共同串联的形式分别连接Ferritin蛋白，经原核体系进行表达得到三种嵌合流感表位的Ferritin-particle：B-(16)4-F，H1-(16)4-F，H3-H1-B-F，经过蛋白纯化，粒径分析，电镜观察进行结构表征，得到三种具有直径在12nm左右的球形结构免疫原进行免疫。
我们使用AS03佐剂与弗氏佐剂分别进行免疫Balb/c雌鼠，以PBS为对照组，B-(16)4-F，H1-(16)4-F，H3-H1-B-F为实验组。检测四次免疫后血清与HA2表位特异性抗体水平，结果表明弗氏佐剂免疫组针对表位特异性抗体效价约为103，AS03佐剂组效价为104且高于弗氏佐剂组，病毒对照组未产生特异性抗体。免后血清分别对H3N2、H1N1、B三种病毒具有一定的结合能力，AS03佐剂组高于弗氏佐剂组。结果说明，两种佐剂均可以增强重组蛋白免疫原性，但AS03佐剂对于重组蛋白免疫原性的增加效果优于弗氏佐剂。抗体分型实验发现，免疫血清IgG1，IgG2a，IgG2b均有显著提升，说明重组蛋白主要诱导体液免疫，但是IgM水平没有明显升高，体液免疫水平并不理想。体外微中和实验结果表明，两种佐剂组免疫后血清与免疫前血清相比，对H3、B两种病毒中和活力明显提高，具有较好的中和活性，其中B-(16)4-F组针对B亚型流感病毒和H3亚型流感病毒均具有中和活性，H3-H1-B-F组和H1-(16)4-F组只针对H3亚型表现出中和能力而没有对B亚型的中和能力，表明本实验所筛选和设计的免疫原B-(16)4-F具有一定的中和能力和潜在的广谱性。小鼠免疫重组蛋白后，进行攻毒实验。每48h测量小鼠体重。攻毒三天后所有小鼠体重出现大幅度下降且出现死亡，6-8天经过免疫重组蛋白的小鼠体重开始逐渐恢复；弗氏佐剂H3-H1-B-F组和B-(16)4-F组的存活率超过80%，H1-(16)4-F组存活率为33.3%。AS03佐剂H3-H1-B-F组和B-(16)4-F组的存活率超过80%，H1-(16)4-F组存活率为66.6%，PBS对照组全部死亡。表明H3-H1-B-F和B-(16)4-F重组蛋白免疫后在小鼠体内能够有效的抑制病毒的感染。
综上，IBV的HA2的保守表位以串联的形式搭载Ferritin载体，针对流感病毒HA2茎部区在病毒感染宿主细胞过程中的构相变化，使表位暴露且能够被免疫系统识别。重组蛋白免疫血清能够对B亚型流感病毒和H3亚型流感病毒均具有中和活性，表明针对于IBV的HA2的保守序列是潜在的广谱中和疫苗候选表位；由于Ferritin的自身免疫原性较强，在搭载分子量大于65kDa的免疫原时，其自身的免疫原性会变得较弱，且会折叠自组装成稳定的三聚体结构，八个三聚体组装成二十四聚体；我们的实验结果表明，Ferritin在搭载分子量小于10kDa的短肽时，其自身的免疫原性仍然较强，能够自组装形成多聚体但组装不完全，可能由于在复性的过程中复性条件剧烈以及在Ferritin折叠成中心镂空的球状结构之后短肽收缩于球状结构内不暴露，免疫原不能被免疫系统较好的识别。因此推测Ferritin可能搭载较大分子量的免疫原时具有较好的免疫原性，但不适合搭载短肽递呈抗原，其递呈短肽的能力弱于Nov-particle，其递呈抗原的大小以及能力需要进一步检验；这种基于结构的、自组装的合成纳米颗粒疫苗可以提高流感病毒免疫的效力和广谱性，并为构建广谱疫苗来抵御新出现的流感病毒和其他病原体提供了支持，为通用性疫苗的设计方式提供了一定的研发思路。
作为流感病毒感染过程的重要功能蛋白，HA一直是科研工作的研究热点。流感病毒HA蛋白具有由3条糖蛋白肽链组成三聚体结构，具有球状的HA1头部结构域与茎杆状的HA2茎部结构域组。其中HA1可以与宿主表面受体唾液酸受体结合，经内吞作用后，HA2在低pH（5-6）条件作用下，发生构象变化，使细胞膜与病毒膜之间的距离逐渐拉近并促进细胞膜与病毒膜融合，膜融合之后HA2隐藏的流感表位会短暂暴露在外并被免疫系统所识别，诱导免疫应答。HA1头部区的氨基酸序列具有高频突变性，极易发生抗原漂移，因此针对于HA1头部区进行疫苗设计是难点之一。HA2茎部区结构相对保守，但是由于感染过程中相对暴露时间短，而且免疫原性差，免疫应答较弱，也是疫苗设计的难点。构建基于HA三聚体结构的重组蛋白，模拟流感病毒感染时的天然构象一直是研究的热点。同时随着针对HA2广谱中和抗体的发现，利用HA2全长或HA2保守区表位作为免疫原诱导广谱中和抗体的方式得了关注。
本课题组龚鑫等人在前期的工组中，筛选出了三条基于HA2的较短的优势表位，发现以诺如病毒P颗粒作为抗原递呈载体，搭载三条优势表位经原核表达免疫动物之后，得到了具有中和活性的抗体，该免疫原可以诱导针对HA2茎部区抗体，阻止HA2结构变化，抑制膜融合。其重组蛋白免疫血清能够针对H3亚型流感病毒具有较好的中和活性；同时针对IBV亚型流感病毒具有一定的中和能力，展示了所筛选的针对于IBV序列的潜在有效性和可能性。由于诺如病毒在人体中可能存在预存免疫，同时为了设计出能够诱导针对IBV的HA2茎部区的中和抗体，本课题重新进行表位筛选、优化和设计，选择新的抗原递呈平台进行实验，期望能够获得针对IBV的HA2的广谱中和抗体。
研究表明铁蛋白（Ferritin）可以自组装形成直径为12nm的24聚体，其N端可以插入外源基因，在插入HA蛋白后可以使蛋白形成三聚体构象。且Ferritin蛋白已经被广泛应用于艾滋病毒和流感病毒的疫苗研究中。
基于上述分析，本课题希望以幽门螺杆菌的Ferritin作为抗原递呈载体搭载我们筛选和预测的保守表位，采用原核体系中表达纯化，表征和免疫后，期望获得针对IBV的HA2的广谱中和抗体。
我们分析了4022株的B型的HA蛋白序列，将筛选的保守序列以多拷贝串联和单拷贝共同串联的形式分别连接Ferritin蛋白，经原核体系进行表达得到三种嵌合流感表位的Ferritin-particle：B-(16)4-F，H1-(16)4-F，H3-H1-B-F，经过蛋白纯化，粒径分析，电镜观察进行结构表征，得到三种具有直径在12nm左右的球形结构免疫原进行免疫。
我们使用AS03佐剂与弗氏佐剂分别进行免疫Balb/c雌鼠，以PBS为对照组，B-(16)4-F，H1-(16)4-F，H3-H1-B-F为实验组。检测四次免疫后血清与HA2表位特异性抗体水平，结果表明弗氏佐剂免疫组针对表位特异性抗体效价约为103，AS03佐剂组效价为104且高于弗氏佐剂组，病毒对照组未产生特异性抗体。免后血清分别对H3N2、H1N1、B三种病毒具有一定的结合能力，AS03佐剂组高于弗氏佐剂组。结果说明，两种佐剂均可以增强重组蛋白免疫原性，但AS03佐剂对于重组蛋白免疫原性的增加效果优于弗氏佐剂。抗体分型实验发现，免疫血清IgG1，IgG2a，IgG2b均有显著提升，说明重组蛋白主要诱导体液免疫，但是IgM水平没有明显升高，体液免疫水平并不理想。体外微中和实验结果表明，两种佐剂组免疫后血清与免疫前血清相比，对H3、B两种病毒中和活力明显提高，具有较好的中和活性，其中B-(16)4-F组针对B亚型流感病毒和H3亚型流感病毒均具有中和活性，H3-H1-B-F组和H1-(16)4-F组只针对H3亚型表现出中和能力而没有对B亚型的中和能力，表明本实验所筛选和设计的免疫原B-(16)4-F具有一定的中和能力和潜在的广谱性。小鼠免疫重组蛋白后，进行攻毒实验。每48h测量小鼠体重。攻毒三天后所有小鼠体重出现大幅度下降且出现死亡，6-8天经过免疫重组蛋白的小鼠体重开始逐渐恢复；弗氏佐剂H3-H1-B-F组和B-(16)4-F组的存活率超过80%，H1-(16)4-F组存活率为33.3%。AS03佐剂H3-H1-B-F组和B-(16)4-F组的存活率超过80%，H1-(16)4-F组存活率为66.6%，PBS对照组全部死亡。表明H3-H1-B-F和B-(16)4-F重组蛋白免疫后在小鼠体内能够有效的抑制病毒的感染。
综上，IBV的HA2的保守表位以串联的形式搭载Ferritin载体，针对流感病毒HA2茎部区在病毒感染宿主细胞过程中的构相变化，使表位暴露且能够被免疫系统识别。重组蛋白免疫血清能够对B亚型流感病毒和H3亚型流感病毒均具有中和活性，表明针对于IBV的HA2的保守序列是潜在的广谱中和疫苗候选表位；由于Ferritin的自身免疫原性较强，在搭载分子量大于65kDa的免疫原时，其自身的免疫原性会变得较弱，且会折叠自组装成稳定的三聚体结构，八个三聚体组装成二十四聚体；我们的实验结果表明，Ferritin在搭载分子量小于10kDa的短肽时，其自身的免疫原性仍然较强，能够自组装形成多聚体但组装不完全，可能由于在复性的过程中复性条件剧烈以及在Ferritin折叠成中心镂空的球状结构之后短肽收缩于球状结构内不暴露，免疫原不能被免疫系统较好的识别。因此推测Ferritin可能搭载较大分子量的免疫原时具有较好的免疫原性，但不适合搭载短肽递呈抗原，其递呈短肽的能力弱于Nov-particle，其递呈抗原的大小以及能力需要进一步检验；这种基于结构的、自组装的合成纳米颗粒疫苗可以提高流感病毒免疫的效力和广谱性，并为构建广谱疫苗来抵御新出现的流感病毒和其他病原体提供了支持，为通用性疫苗的设计方式提供了一定的研发思路。