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乳腺癌是严重威胁女性健康的一类恶性肿瘤,然而乳腺癌患者的真正死因往往是乳腺癌转移,因为大部分原位乳腺癌可以通过手术切除而治愈。骨和骨髓是乳腺癌转移的常见部位,70%的乳腺癌致死病人存在骨转移。而且,骨转移通常伴有剧烈的疼痛、病理性骨折、脊髓压迫等严重并发症,造成患者生活质量明显下降。而化疗、激素治疗和手术对骨转移灶治疗效果欠佳。现有的诊断技术通常很难在早期准确预测乳腺癌骨转移的进程。因此,探索乳腺癌骨转移治疗药物新靶点和检测标志物十分必要。骨唾液酸蛋白(bone sialoprotein,BSP)是骨基质中一种高度磷酸化和糖基化的分泌性蛋白,属于SIBLINGs家族。BSP并非骨特异性限制表达,多项研究显示BSP在乳腺癌骨转移中扮演重要角色,且与预后不良有关。大部分乳腺癌病人(大约87%)BSP水平升高,而且术前血清BSP水平高的病人术后骨转移风险高。因此BSP可以作为骨转移检测的血清标志物。过表达BSP促进小鼠模型中人乳腺癌细胞发生骨转移,而通过抗体技术或反义核酸技术下调BSP可以抑制裸鼠模型中乳腺癌引起的溶骨性骨转移。而且,BSP有利于破骨细胞的存活,能够抑制其凋亡,从而促进溶骨性骨损伤形成。因此,BSP基因表达与乳腺癌病人的骨转移风险有关,降低BSP水平可能能够抑制骨转移风险。目前报道的降低BSP水平的方法,包括BSP抗体技术和BSP反义核酸技术。本课题旨在探索BSP基因沉默对乳腺癌细胞(MDA-MB-231BO)骨转移能力的影响,为以BSP为靶点的乳腺癌骨转移预防和靶向治疗提供实验依据。本实验室前期构建了一株BSP基因沉默的乳腺癌细胞MDA-MB-231BO-BSP27,与沉默前相比BSP蛋白表达抑制率约69.3%。本课题利用MTS法检测BSP基因沉默对乳腺癌细胞增殖能力的影响;体外骨片粘附实验检测细胞与小鼠骨基质粘附能力;通过扫描电子显微镜(SEM)和透射电子显微镜(TEM)观察BSP基因沉默对亲骨转移乳腺癌细胞超微结构的影响;ELISA法检测骨基质细胞粘附培养上清中TGF-β1和RANKL表达分泌量差异。同时,应用鸡胚尿囊绒毛膜模型检测BSP基因沉默对血管侵袭能力的影响。最终,通过裸鼠左心室注射骨转移模型检测乳腺癌细胞的体内骨转移能力。本实验的主要研究结果如下:(1)亲骨转移乳腺癌细胞易与骨基质发生粘附,粘附部位可见骨吸收造成的骨基质破坏;稳定沉默BSP基因可以有效抑制乳腺癌细胞与骨片的粘附能力,抑制率达53.11%。同时,BSP基因沉默的乳腺癌细胞的增殖能力也受到影响,在24 h、48 h和72 h的增殖抑制率分别为16.61%、21.84%和18.64%。(2)电子显微镜观察结果提示BSP基因沉默组部分肿瘤细胞表面超微结构存在异常,但胞内结构没有明显变化。沉默组中部分细胞表面突起减少或脱落,长突起减少,细胞表面出现小孔。这些变化可能与BSP基因沉默有关。(3) ELISA结果提示沉默BSP基因对骨基质分泌TGFβ1和RANKL有抑制作用,抑制率分别为56.12%和18.71%。(4)鸡胚CAM血管侵袭实验结果显示BSP基因沉默组乳腺癌细胞的血管侵袭能力下降。(5)裸鼠实验证实BSP基因沉默可抑制亲骨转移乳腺癌细胞形成骨转移:骨组织的X线检测结果显示部分裸鼠出现骨质破坏的现象;HE染色和BSP免疫组织化学染色结果显示沉默BSP基因可以明显降低乳腺癌细胞的骨转移发生率;TRAP染色表明乳腺癌细胞可以促进破骨细胞分化和成熟,破骨细胞常见于转移灶边缘,推测其可以促进乳腺癌骨转移形成溶骨性骨质破坏。