氨氮是养殖水环境中重要的污染胁迫因子。本文通过对三疣梭子蟹免疫相关功能基因的克隆和表达研究,研究了氨氮胁迫对免疫相关指标、基因表达及代谢指标的影响,初步探讨了三疣梭子蟹在氨氮胁迫下的免疫应答及解毒代谢机制,主要包括三方面内容：(1)免疫相关基因抗菌肽crustin和抗脂多糖因子(ALF)、溶菌酶、酚氧化酶原(proPO)、类α2-巨球蛋白(类α2-M)的克隆和表达分析；(2)氨氮胁迫对三疣梭子蟹免疫机能评价指标的影响；(3)氨氮胁迫对三疣梭子蟹解毒代谢指标的影响。主要结果如下：1三疣梭子蟹免疫相关基因的克隆与表达分析通过RACE方法从三疣梭子蟹血细胞中克隆得到两条抗菌肽基因crustin和ALF,分别命名为Ptcrustin和PtALF。Ptcrustin cDNA全长584 bp,开放阅读框(ORF)长333 bp,编码110个氨基酸,包括一个含21个氨基酸的N-端信号肽和一个含89个氨基酸的成熟肽,成熟肽理论分子量为10.08kDa,pI为7.93;PtALF cDNA全长1050 bp, ORF为372 bp,编码123个氨基酸,包括一个26个氨基酸的N-端信号肽和一个97个氨基酸的成熟肽,成熟肽理论分子量为11.35kDa, pⅠ为10.19。Ptcrustin含有一个WAP结构域,由8个半胱氨酸(Cys)残基构成的4二硫核心(4-DSC)组成, Ptcrustin氨基酸序列与其它虾蟹类相似性为52%-81%；同其它ALF一样,PtALF含有2个保守的Cys残基构成1个二硫键,PtALF氨基酸序列与其它虾蟹类相似性为58%-87%。实时定量PCR研究发现Ptcrustin mRNA在血细胞中表达量最高,在胃中也有较高表达,在肝胰脏、肌肉、鳃和心脏中表达量很低；而PtALF mRNA在血细胞、肝胰脏、肌肉、鳃、胃和心脏中均有较高表达。注射溶藻弧菌后Ptcrustin和PtALF mRNA表达均显著增加,二者趋势基本一致,结果表明,注射溶藻弧菌能引起抗菌肽crustin和ALF基因表达显著上调(P<0.05),参与免疫防御反应。通过RACE方法从三疣梭子蟹血细胞中克隆得到一条溶菌酶基因。溶菌酶cDNA全长984 bp, ORF为672 bp,编码223个氨基酸,包括一个含18个氨基酸的N-端信号肽和一个含205个氨基酸的成熟肽,成熟肽理论分子量为23.76kDa, pI为7.57。三疣梭子蟹溶菌酶氨基酸序列与其它虾类相似性为75%-77%。同其它C-型溶菌酶一样,三疣梭子蟹溶菌酶两个非常保守的酶催化位点Glu51、Asp69残基及8个保守的Cys残基,证明其为C-型溶菌酶；此外,三疣梭子蟹C-型溶菌酶蛋白中含有三个Ca2+结合功能位点Asp98, Asp103和Asp104,说明其可能属于Ca2+结合C-型溶菌酶。实时定量PCR研究发现C-型溶菌酶mRNA在血细胞中表达最高,在鳃、肝胰脏、肌肉中也有较高表达,在胃和心脏中表达很低。注射溶藻弧菌后,C-型溶菌酶mRNA表达在3h时显著降低,3h后趋于稳定,并与对照组差异显著(P<0.05)；24 h时C-型溶菌酶mRNA表达显著上升,迅速恢复至对照组水平。通过设计兼并引物,利用PCR方法从三疣梭子蟹血细胞中克隆得到一条proPO和一条类α2-M部分基因序列。proPO cDNA片段长551 bp,编码183个氨基酸序列；proPO氨基酸序列与其它虾蟹类相似性为73%-94%。克隆的proPO部分氨基酸序列中含有1个保守的组氨酸残基及两个糖基化位点区域,分别是Asn-Ser-Asn (NSN)和Asn-Thr-Leu (NTL)。类α2-M cDNA片段长2685 bp, 3’UTR为1165 bp, ORF部分序列为1520bp,编码505个氨基酸序列；类α2-M氨基酸序列与其它虾蟹类相似性为65%-71%。与其他物种一样,三疣梭子蟹类α2-M也含有一个保守的硫酯区域(CGEQNM)和一个由90个氨基酸残基组成的C-端受体结合区域,此外类α2-M还含有一个理论的糖基化位点Asn-Glu-Ser (NES)。2氨氮胁迫对三疣梭子蟹免疫机能评价指标的影响本文研究了氨氮胁迫对三疣梭子蟹多巴胺含量、proPO系统和免疫相关指标及其mRNA表达的影响。结果表明,各处理组血淋巴多巴胺含量于6h达到最大值,12h后恢复至对照组水平。各处理组三类血细胞数量、总血细胞数量和吞噬率均明显下降,并与氨氮浓度呈显著负相关(P<0.05)。血细胞proPO活力呈明显下降趋势,12h时趋于稳定,稳定后1mg/L处理组proPO活力恢复至对照组水平,5、20m/L处理组proPO活力与氨氮浓度呈明显负相关(P<0.05)。各处理组类α2-M活力呈明显峰值变化,于6h时达到最小值,12h后趋于稳定并恢复至对照组水平。各处理组抗菌和溶菌活力在12h内显著降低,12h后5、20mg/L处理组溶菌活力与氨氮浓度呈明显负相关(P<0.05),其它各组均恢复至对照组水平。氨氮胁迫后,5和20 mg/L处理组proPO mRNA表达明显升高,于6h后趋于稳定；各处理组类α2-M mRNA表达均呈明显的峰值变化,于6h达到最高值(P<0.05),24 h后显著下降至对照组水平；20mg/L处理组的crustin和溶菌酶mRNA表达均显著降低,于6h达到最小值(P<0.05),12h后趋于稳定并恢复至对照组水平；5和20 mg/L处理组的ALF mRNA表达显著降低,于6h达到最小值后趋于稳定并与对照组差异显著(P<0.05)；而其它处理组crustin、ALF和溶菌酶mRNA表达无显著变化。由此说明,氨氮胁迫对三疣梭子蟹免疫力有很大的毒害作用,影响免疫相关基因的表达。3氨氮胁迫对三疣梭子蟹解毒代谢指标的影响本文研究了氨氮胁迫对三疣梭子蟹肝胰脏、鳃、血淋巴和肌肉中精氨酸酶活力、尿素含量、谷氨酰胺合成酶(GS)活力和谷氨酰胺含量的影响。结果表明,氨氮对各组织氨氮解毒代谢指标的影响显著(P<0.05)。氨氮胁迫后,肝胰脏、鳃和血淋巴各处理组精氨酸酶活力均显著升高,分别于6h或12h达到最大值,各组织20 mgg/L处理组精氨酸酶活力与对照组相比分别增加了233.1%、111.1%和151.5%,12 h或24 h后均趋于稳定,稳定后5和20 mg/L处理组精氨酸酶活力均与氨氮浓度呈显著正相关(P<0.05)。除血淋巴和肌肉中1 mg/L处理组尿素含量无显著变化外,其它各处理组尿素含量均显著升高,分别于6h、12h或24h达到最大值(P<0.05),与对照组相比,各组织20 mg/L处理组尿素含量分别增加了132.2%、230.4%、48.7%和118.2%。肝胰脏中5、20 mg/L处理组和鳃中各处理组GS活力均显著上升,分别于12h或24 h后趋于稳定,稳定后各处理组GS活力均与氨氮浓度呈明显正相关(P<0.05)；血淋巴中5、20 mg/L处理组GS活力呈上升趋势,48 h达到最大值并与对照组差异显著(P<0.05),1mg/L处理组未有显著变化；肌肉中各处理组GS活力呈上升趋势,24 h后均趋于稳定,稳定后仅1 mg/L处理组与对照组差异显著(P<0.05)。氨氮胁迫后,肝胰脏、鳃、血淋巴和肌肉中各处理组谷氨酰胺含量均显著上升,分别于6h、12h或24 h时达到最大值(P<0.05),各组织20 mg/L处理组谷氨酰胺含量与对照组相比分别增加了195.7%、332.3%、93.5%和69.6%,肝胰脏、鳃各处理组在稳定后均与氨氮浓度呈明显正相关性(P<0.05)。由此说明,氨氮胁迫可诱导三疣梭子蟹各组织尿素和谷氨酰胺的合成增加,减少氨氮对机体的毒害作用。