研究背景骨性关节炎(osteoarthritis, OA)作为一种常见的关节疾病,在50岁以上人群中,发病率高居致残疾病的第二位,是影响老年人身体健康的常见病和多发病。OA的主要病理表现为进行性的软骨退变、龟裂和缺损,而周围软骨对病损缺乏自愈能力。明确OA持续进展的原因,针对性地采取遏制性治疗措施,是突破该疾病保守治疗难题的关键所在学术界对OA关节软骨进行性退变和破坏的原因从不同角度进行了大量研究,但其发病机制仍未完全阐明。凋亡被认为是软骨退变的关键性病理因素。Mollenhauer和Mok研究发现：凋亡细胞更多出现在OA软骨表层,以及软骨缺损灶周围。由于OA软骨缺损都始于软骨表层且大多存在于软骨表层,这些凋亡细胞的异常层间差异分布,被认为是软骨缺损灶周围组织丧失缺损修复能力的关键原因。在OA患者的关节腔内存在高浓度的的活性氧歧化物(reactive oxygen spesies, ROS)。ROS攻击软骨细胞后,会引发膜脂质过氧化,使脂质过氧化代谢产物增多,这些产物又可直接攻击软骨细胞DNA,影响DNA的合成,最终导致细胞凋亡。Loeser和Carlson研究发现毒性的ROS造成细胞内蛋白质硝化,而这些硝化蛋白质多位于OA表层的软骨细胞内,间接反映出毒性ROS在软骨组织层间差异分布的现象。这种毒性ROS的在OA软骨表层聚集的现象,与OA软骨细胞凋亡表层聚集现象之间,可能存在着某种因果关系。文献关于毒性ROS层间差异分布的描述,使ROS的“清道夫”——抗氧化酶Peroxiredoxins(Prxs)家族受到关注。哺乳动物中至少存在六种Prx亚型(Prx Ⅰ-Ⅵ),它们可分为三个亚类：①典型2-Cys Prxs(Prx Ⅰ-Ⅳ)；②不典型2-Cys Prx(Prx Ⅴ)；③1-Cys Prx(PrxⅥ).Prxs家族成员均可利用蛋白中巯基提供的还原电子将组织中的氧自由基还原成无毒分子。Prxs通过其本身的过氧化物酶活性在细胞内起抗氧化作用(ROOH+2e—→ROH+H2O),可将机体内产生的氢氧化物、过氧化亚硝酸盐和许多种有机氢过氧化物还原或降解,其抗氧化作用能力在某种程度上与谷光甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GPX)和过氧化氢酶(catalase,Cat)相似。Prxs家族广泛分布于细胞内,其功能涵盖抗氧化应激、促进细胞增殖和调节细胞内信号转导。作为细胞内毒性ROS的清除剂和凋亡保护因子,Prxs在OA软骨组织中究竟扮演什么角色值得关注课题组前期通过双向凝胶电泳和质谱分析,对正常和OA软骨组织进行差异蛋白研究,发现在OA软骨细胞中,Prxs家族成员之一——Prx Ⅰ,在OA软骨组织细胞中高表达。理论上,Prx Ⅰ高表达赋予软骨细胞更强的抗凋亡能力,但是,这种高表达为什么没有带来预期的凋亡保护效应?Prx Ⅰ的这种高表达是否出现在软骨中毒性ROS最富集的表层?上述诸多问题成为课题组关注的焦点。因此,本研究拟应用蛋白免疫印迹技术(Western blot,WB)和免疫组织化学检测方法观察Prx Ⅰ在正常和OA软骨中的表达和分布情况,并通过siRNA敲降软骨细胞中的Prx Ⅰ来模拟其在表层OA软骨中Prx Ⅰ的表达下调现象,了解OA软骨表层细胞中PrxⅠ下调表达对软骨细胞耐受毒性ROS和抗凋亡能力的影响,探讨Prx Ⅰ对于OA凋亡软骨细胞和毒性ROS表层富集现象的意义,旨在阐释OA软骨组织病理改变缺乏自愈能力的内在原因。目的研究Prx I在正常和OA软骨中的表达及分布特点,了解PrxⅠ在OA软骨组织中是否具备层间分布差异,并通过siRNA敲降软骨细胞中的Prx Ⅰ,模拟Prx Ⅰ在表层OA软骨中的表达下调现象,观察Prx Ⅰ下调表达对软骨细胞耐受毒性ROS和抗凋亡能力,探讨Prx Ⅰ对于OA凋亡软骨细胞和毒性ROS表层富集现象的意义,旨在阐释OA软骨组织病理改变缺乏自愈能力的内在原因。方法1.观察Prx Ⅰ在正常和OA软骨组织中的表达及分布特点应用WB技术检测Prx Ⅰ在正常与OA软骨组织中表达量的总体差异。应用免疫组织化学法观察Prx Ⅰ在正常与OA软骨组织中的表达、分布特点,了解Prx Ⅰ是否存在层间差异分布。2.人软骨细胞的分离与培养采用酶消化和酶预消化组织贴块两种方法培养原代软骨细胞,同时进行ⅠⅠ胶原免疫组化鉴定。3.验证Prx Ⅰ在体外培养的软骨细胞中具有抗氧化作用(1)应用Primer3.0软件设计对应于Prx Ⅰ的siRNA。选取分支最高的3个siRNA(序列A:5’-GAU GGU CAG UUU AAA GAU ATT-3’; B:5’-GCC GAA UUG UGG UGU CUU ATT-3’; C:5’-GGG UCA AUA CAC CUA AGA ATT-3’;)进行生物合成。应用脂质体LipofectamineTM2000承载siRNA转染第2代培养软骨细胞,通过湮灭软骨细胞中Prx I mRNA,实现敲降Prx Ⅰ表达的生物效应。siRNA序列A、B、C分别转染软骨细胞,在转染后72h收获细胞,提取可溶性蛋白质,应用WB技术对比观察转染和正常软骨细胞中Prx Ⅰ的表达水平,筛选敲降效率最高的siRNA。应用上一步筛选的siRNA转染软骨细胞,在转染后0h、24h、48h、72h、96h、120h分别收获细胞提取可溶蛋白,应用WB技术对比观察软骨细胞中Prx Ⅰ的表达水平,筛选敲降效率最高的siRNA持续作用时间点。(2)软骨细胞随机分为正常组和Prx Ⅰ敲降组,在敲降Prx Ⅰ效率最高的时间点,应用终浓度0.6mM H202分别刺激两组软骨细胞,在刺激持续0min、90min、180min时间点分别收获细胞,应用WB技术检测软骨细胞中早期凋亡指标：活性caspase和前体caspse3蛋白含量的差异。同时,应用流式细胞仪检测两组细胞在0.6mM H2O2刺激下,在作用持续Omin、30min、90min、180min时间点,软骨细胞中annexin V/PI标记细胞的凋亡比例。通过探讨Prx Ⅰ表达水平下调对于软骨细胞拮抗毒性ROS和相应抗凋亡能力的变化,明确OA软骨表层细胞中Prx Ⅰ表达水平下调对于表层软骨凋亡细胞富集现象之间的关联。结果1.Prx Ⅰ在正常和OA软骨组织中的表达及分布特点(1)WB结果示：正常组与OA组Prx Ⅰ蛋白相对表达量分别为1.014±0.189和3.893±0.693,经统计学分析,OA软骨组织细胞中表达水平较正常软骨组织细胞平均升高2.89倍(t=18.34,P<0.05)。(2)免疫组织化学染色显示：Prx Ⅰ在正常软骨组织表层、中层和深层中的表达和分布相对均匀。在中度OA软骨组织,Prx Ⅰ在深层软骨细胞中表达显著升高,胞浆普遍黄染,颗粒状着色明显；在中层软骨细胞中,Prx Ⅰ表达丰度较深层软骨细胞稍弱；在表层软骨细胞中,Prx Ⅰ阳性着色颗粒较少,大部分细胞胞浆中仅被着色为淡黄色。在重度OA软骨组织,Prx Ⅰ的层间差异表达在重度OA软骨组织中表现更为明显。在磨损和纤维化的软骨表层,大部分细胞Prx Ⅰ染色微弱,甚至缺如；但是,在中层和深层软骨组织细胞中,Prx Ⅰ呈现深棕黄色颗粒,占据除细胞核外侧整个细胞轮廓,同时,在软骨细胞周围还可见Prx Ⅰ呈云雾状阳性着色,以旁分泌形式向细胞周围基质排泄。2.人软骨细胞的分离与培养酶消化法分离的软骨细胞通常在12-24h陆续贴壁,原代细胞均匀分布呈梭形、多角形,胞浆丰富,圆形的细胞核居细胞中央,边缘光滑锐利。酶预消化组织块法培养2-3天后可见组织块上细胞密集成圆形,部分细胞开始伸展,细胞体较瘦小,组织块周围未见细胞爬出,培养第4-5d后,部分组织块周围开始有细胞迁出,之后迁出的细胞逐渐增多,组织块周围爬满细胞,呈放射状生长,细胞形态主要为梭形和多角形,胞体较小。原代细胞消化传代后,细胞主要呈梭形或多角形,细胞体积较原代细胞增大。第4代软骨细胞开始出现去分化的现象,细胞触角开始增多,细胞体积较大,胞浆增多且颗粒增多,核仁肥大,细胞边界不清常重叠。原代软骨细胞培养1周后Ⅱ型胶原染色鉴定,细胞内着色为棕黄色,呈阳性。3.Prx Ⅰ在体外培养的软骨细胞中抗氧化作用验证(1)羧基荧光素(Carboxyfluorescein, FAM)标记的siRNA转染原代软骨细胞,转染4h后,荧光显微镜下观察85%～90%的细胞呈现绿色荧光,转染效率满足实验要求。(2)采用A、B、C三个siRNA分别对软骨细胞Prx Ⅰ基因的表达进行干扰,结果显示：在siRNA作用后72h,A、B、C三组对应的Prx Ⅰ相对表达量分别为0.778±0.498、0.318±0.300和0.223±0.129,相对于阴性对照组分别平均降低22.2%(F=459.858,P<0.001),68.2%(F=459.858,P<0.001)和77.7%(F=459.858,P<0.001),可见,C序列siRNA具备最佳的Prx Ⅰ敲降效率。(3)后续试验选择C序列siRNA敲降软骨细胞中Prx Ⅰ的表达。结果显示在siRNA作用24h、48h、72h、96h、120h后,Prx Ⅰ相对表达量水平分别为0.837±0.222、0.531±0.015、0.214±0.016、0.314±0.029和0.392±0.020,较阴性对照组平均降低16.3%(F=746.383,P<0.001)、46.9%(F=746.383,P<0.001)、78.6%(F=746.383,P<0.001)、68.6%(F=746.383,P<0.001)和60.8%(F=746.383,P<0.001),可见,序列CsiRNA在作用72h时间点,可能获得最佳的Prx Ⅰ敲降效能。(4)敲降Prx Ⅰ后软骨细胞抗ROS刺激和抗凋亡能力的影响在接受H202刺激后,Prx Ⅰ敲降组和阴性对照组凋亡细胞比例均随着刺激时间的延长而同步增加,但是,在不同的时间点,Prx Ⅰ敲降组的凋亡细胞比例均显著高于阴性敲降对照组。对照组在0.6mM H2O2刺激后90min和180min时间点,前体caspase3的相对表达量分别为0.563±0.017和0.326±0.015,两个时间点较NC对照前体caspase3水平分别平均降低43.7%(F=2310.82,P<0.001)和67.4%(F=2310.82,P<0.001),而活性caspase3的相对表达量为1.218±0.093和4.264±0.118,较NC对照组分别升高21.8%(F=2981.36,P>0.05)和326.4%(F=2981.36,P<0.001)。相比之下,Prx Ⅰ敲降组在90min和180min,前体caspase3的相对表达量为0.541±0.011和0.173±0.012,两个时间点较NC对照水平分别平均降低42.9%(F=2310.82,P<0.001)和82.7%(F=2310.82,P<0.001),而活性caspase3相对表达量为5.543±0.091和7.761±0.1048,较正常组NC对照分别升高454.3%(F=2981.36,P<0.001)和676.1%(F=2981.36,P<0.001)。在90min和180min两个时间点,敲降组与对照组相比前体caspase3表达量分别平均降低3.9%(t=一0.715,P=0.51)和46.9%(t=13.177,P<0.05),而敲降组与对照组相比活性caspase3表达量分别平均升高355.1%(t=一57.332,P<0.05)和82.0%(t=—38.322,P<0.05)。在H202作用0min、30min、90min、180min时间点,流式细胞仪检测AnnexinV/PI双染软骨细胞,正常对照组早期和晚期凋亡细胞比例之和分别为4.72%±1.05%、10.43%±1.10%、20.14%±0.89%、30.30%±0.95%,而Prx Ⅰ敲降组分别为4.83%±0.89%、16.53%±0.90%、30.62%±1.10%、68.54%±1.24%。90min和180min早期和晚期凋亡细胞比例之和,敲降组较对照组凋亡细胞率平均增加52.0%(t=一12.779,P=0.03)和126.2%(t=一42.195,P=0.14)。结论(1)本研究在前期双向凝胶电泳研究提示Prx Ⅰ在OA软骨细胞中表达上调的基础上,进一步通过WB证实上调表达,并应用免疫组化技术观察总体上调表达的Prx Ⅰ在OA组织中的表达和分布特点。结果显示：虽然Prx Ⅰ在OA软骨细胞中的总体表达水平升高2.89倍,但是,Prx Ⅰ上调表达却主要集中在OA软骨深层。相反,在表层软骨细胞中,Prx Ⅰ的表达水平反而显著降低,甚至缺如。(2)Prx Ⅰ在OA软骨表层细胞中表达下调,将显著降低该层软骨细胞对毒性ROS的解毒和耐受能力,导致细胞在毒性ROS的刺激下,更易于被诱导凋亡,最终导致凋亡细胞在软骨表层富集。Prx Ⅰ在OA软骨组织表层细胞中的下调表达,是表层凋亡细胞富集的深层次原因。