论文部分内容阅读
慢性阻塞性肺疾病简称"慢阻肺",是一种以呼吸道气流受限为特征的呼吸道疾病,病情常呈进行性发展.小气道结构重塑被认为是造成气道气流受限的重要原因之一,病理学显示为气道管壁增厚变形,其中又以平滑肌增厚最显著,从而导致气道重塑.吸烟是导致COPD发生发展的主要原因.烟草烟雾成分十分复杂,尼古丁是其最主要的有害成分之一,因此探讨尼古丁对气道平滑肌细胞增殖的影响尤为重要.本实验通过观察尼古丁刺激对人支气管平滑肌细胞内钙离子浓度及细胞膜上瞬时受体电位通道(Transient Receptor Potential Canonical Channels,TRPC)表达水平变化,这种变化是否通过烟碱型乙酰胆碱受体亚基(nAChRs)介导,从而探讨尼古丁在COPD气道重塑发生中的可能作用机制,为COPD的防治提供新的靶点. 目的： 本研究旨在：1、明确尼古丁是否能够促进人支气管平滑肌细胞增殖和收缩.2、观察尼古丁刺激对HBSMCs中TRPC6蛋白表达的影响;以及对细胞基础钙、受体操纵性钙内流(receptor-operated calcium entry,ROCE)和钙池操纵性钙内流(store-operated calcium entry,SOCE)的影响.3、应用特异性小分子干扰RNA(Small interfering RNA,siRNA)沉默TRPC6表达,观察尼古丁是否通过TRPC蛋白调节细胞增殖收缩以及相关病理生理学改变.4、研究HBSMCs上nAChRs亚基的表达情况,观察尼古丁刺激对α7nAChR亚基表达的影响,并探讨其与PI3K/Akt通路的关系,从而阐述尼古丁致HBSMCs增殖和收缩的机制,为慢阻肺防治提供新的靶点. 方法： 1.细胞培养 购买的原代人支气管平滑肌细胞复苏传代培养,2-8代细胞用于实验. 2.CCK-8法检测细胞活力 不同浓度尼古丁作用HBSMCs不同时间,根据日本同仁CCK-8细胞毒性检测试剂说明书.向96孔板中加入2000个细胞/孔,加入尼古丁作用一段时间后向每孔细胞中加入10μl CCK-8试剂,37℃生化培养箱继续孵育3小时,然后在450nm波长处测定细胞吸光度值来检测细胞增殖活力. 3.Beckman Z2细胞计数仪检测 胰酶消化细胞,收集各孔细胞悬液,应用Beckman Z2细胞分析计数仪进行细胞计数分析. 4.EdU法细胞增殖比例检测 根据广州锐博EdU细胞增殖检测试剂盒观察EdU对处于S期细胞核呈红色荧光染色,荧光显微镜观察计算EdU掺入率来判断细胞增殖改变. 5.荧光定量PCR Trizol法提取HBSMCs RNA,逆转录反应根据TAKARA公司RT试剂盒进行,荧光定量PCR反应是根据Bio-Rad公司荧光定量PCR试剂盒说明书建立.反应产物的特异性通过溶解曲线为单峰来判断. 6.免疫印迹实验(Western blotting) 经不同处理的细胞中加入预冷的含PMSF的Cell Lysis Buffer试剂,然后用细胞刮收集并离心细胞收集蛋白裂解液.蛋白浓度用BCA法测定,然后等量蛋白上样,10-12%SDS-PAGE胶分离,分离后的蛋白转到PVDF膜上,用含5%奶粉的TBST封闭,然后加入一抗4℃孵育过夜,TBST洗涤三次,加入二抗室温孵育1小时,洗掉二抗,加入ECL曝光. 7.siRNA转染 siRNA序列由苏州吉玛公司合成,转染方法均按照Invitrogen公司lipofectamine RNAiMAX试剂说明书进行.细胞转染前换上无血清无抗生素的培养基,转染后12h换上完全培养基.然后进行后续实验. 8.细胞内钙离子浓度检测 HBSMCs中加入7.5μM Fura2-AM,37℃培养箱孵育45min,将玻片放入小室,然后将小室放入倒置显微镜下用PSS灌流,灌流后10分钟开始用荧光显微镜检测细胞内Fura-2荧光信号,然后用InCyte软件检测细胞信号,细胞内钙离子浓度由Fura-2荧光比值计算获得. 结果： 1.尼古丁(10-5M,48h)能够促进人支气管平滑肌细胞的增殖和收缩. 2.尼古丁(10-5M,48h)刺激可以上调人支气管平滑肌细胞TRPC6mRNA和蛋白水平.尼古丁(10-5M,48h)刺激可以增加人支气管平滑肌细胞基础钙、ROCE和SOCE.特异性的siTRPC6可以抑制尼古丁引起的细胞增殖和收缩、基础钙、ROCE和SOCE的上调.说明TRPC6参与了尼古丁对人支气管平滑肌细胞细胞内钙离子浓度的调节. 3.尼古丁刺激可以上调人支气管平滑肌细胞上α7nAChR亚基蛋白的表达.α7nAChR抑制剂或siRNA可以抑制尼古丁引起的TRPC6蛋白表达的上调,抑制尼古丁引起的细胞增殖和收缩、基础钙、ROCE和SOCE的上调.说明尼古丁通TRPC6引起的人支气管平滑肌细胞增殖收缩需要α7nAChR亚基的介导. 4.尼古丁使人支气管平滑肌细胞磷酸化AKT水平增加.PI3K抑制剂LY294002抑制了TRPC6和α7nAChR蛋白表达、以及尼古丁引起的细胞增殖和收缩、基础钙、ROCE和SOCE的上调.α7nAChR抑制剂或siRNA可以抑制尼古丁引起的AKT磷酸化. 结论： 人支气管平滑肌细胞表达nAChRs,尼古丁可能通过上调α7nAChR亚基,并激活PI3K/AKT通路,从而增加TRPC6蛋白的表达、ROCE和SOCE水平,增加细胞内钙浓度,进而促进平滑肌细胞增殖和收缩.