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研究背景与目的重症肌无力（Myasthenia gravis,MG）的病理特征是神经肌肉接头（Neuromuscular junction,NMJ）突触后膜的自身免疫性损伤导致突触后膜乙酰胆碱受体（Acetylcholine receptor,AChR）聚集障碍。而低密度脂蛋白受体相关蛋白4（Low-density lipoprotein receptor-related protein 4,LRP4）参与并介导的Agrin-LRP4-肌肉特异性受体酪氨酸激酶（Muscle-specific receptor tyrosine kinase,MuSK）信号级联通路,在终板膜AChR聚集过程中发挥了重要作用,并也是MG重要发生机制之一。分拣微管连接蛋白17（Sorting nexin 17,SNX17）是位于胞内的一种衔接蛋白,因对NPxY/NxxY基序具有高亲和力,能够结合包含NPxY/NxxY基序的多种内化膜蛋白（如低密度脂蛋白受体家族成员）,使其内化后避免进入溶酶体降解,介导其再循环回膜从而再次发挥受体功能。LRP4作为低密度脂蛋白受体家族中的一员,其胞内区亦存在NPxY基序。并且,在本课题组的前期研究中发现MG患者肋间肌中SNX17与AChR共定位,并初步确认了SNX17与LRP4的胞外互作关系,这为SNX17通过与LRP4互作进而影响AChR聚集提供了可能。因此本研究将利用肌管细胞及实验性自身免疫性MG（Experimental autoimmune MG,EAMG）小鼠模型,敲低或过表达SNX17,探讨SNX17是否能通过调控内化LRP4的再循环从而影响AChR聚集进而在MG中发挥保护性作用。研究方法1.2%马血清诱导C2C12细胞分化为肌管细胞,筛选诱导膜上LRP4蛋白内化的LRP4抗体最佳刺激浓度及内化LRP4蛋白的最适循环回膜时间。2.免疫共沉淀验证SNX17与LRP4的相互作用关系。3.SNX17敲低和过表达慢病毒转染C2C12细胞,western blot和qPCR检测细胞中SNX17蛋白和mRNA的表达。4.Western blot检测膜蛋白中LRP4蛋白及细胞中磷酸化MuSK的含量,验证SNX17敲低或过表达对内化LRP4循环回膜及MuSK磷酸化的影响。5.免疫荧光染色检测SNX17敲低和过表达肌管细胞上AChR的聚集,统计AChR聚集的数量和长度。6.建立EAMG小鼠模型并对EAMG模型进行评估,western blot检测EAMG小鼠腓肠肌中SNX17、LRP4及磷酸化MuSK的表达,免疫荧光染色观察肌丝上AChR的形态结构。7.建立SNX17敲低和过表达EAMG小鼠模型,western blot和qPCR检测小鼠腓肠肌中SNX17蛋白和mRNA的表达。8.对SNX17敲低和过表达EAMG小鼠分别进行:（1）Western blot检测腓肠肌中LRP4及磷酸化MuSK的表达;（2）免疫荧光染色观察肌丝上AChR的形态结构;（3）HE染色观察肌纤维的病理结构;（4）低频重复神经电刺激检测腓肠肌的肌电图;（5）测量小鼠腿部肌力等;以探讨SNX17在EAMG小鼠模型中的作用。研究结果1.在使用2%马血清诱导第6天,C2C12细胞成功分化为肌管细胞;LRP4抗体的最佳刺激浓度为10μg/mL,内化LRP4循环回膜的最适时间为30 min。2.当沉淀SNX17或沉淀LRP4蛋白时,均能在下拉蛋白中检测到LRP4或SNX17蛋白,证明SNX17与LRP4之间具有胞内互作关系。3.SNX17敲低慢病毒对C2C12细胞的转染效率高于90%,细胞中SNX17蛋白和mRNA的表达均显著降低（P＜0.01）。4.SNX17敲低后,内化LRP4的循环回膜量、MuSK的磷酸化水平及AChR的聚集数量均显著降低（P＜0.05）。5.SNX17过表达慢病毒对C2C12细胞的转染效率高于85%,细胞中SNX17蛋白和mRNA的表达均显著增加（P＜0.01）。6.SNX17过表达后,内化LRP4的循环回膜量、MuSK的磷酸化水平及AChR的聚集数量均显著增加（P＜0.05）。7.EAMG小鼠模型成功构建,造模成功率为65%,EAMG小鼠腓肠肌中SNX17、LRP4及磷酸化MuSK的表达均降低（P＜0.05）,肌丝上AChR的形态结构不完整,呈明显的碎片化。8.SNX17敲低EAMG小鼠模型在病毒感染21天后成功构建,腓肠肌中SNX17蛋白和mRNA的表达均显著降低（P＜0.01）。9.SNX17敲低后,降低了腓肠肌中LRP4及磷酸化MuSK的表达（P＜0.05）,加剧了肌丝上AChR的碎片化程度和肌纤维的病理性损伤,肌电图第五波幅衰减率降低至46.5%。10.SNX17过表达EAMG小鼠模型在病毒感染21天后成功构建,腓肠肌中SNX17蛋白和mRNA的表达均显著增加（P＜0.001）。11.SNX17过表达后,增加了腓肠肌中LRP4及磷酸化MuSK的表达（P＜0.05）,改善了肌丝上AChR的碎片化程度和肌纤维的病理性损伤,肌电图第五波幅衰减率上升至12.3%,小鼠的腿部力量显著增加（P＜0.001）。研究结论1.SNX17可与内化的LRP4相互作用,介导LRP4再循环回膜,并在Agrin的刺激下,促进肌管细胞中MuSK的磷酸化及AChR的聚集。2.基于上述机制,上调EAMG小鼠腓肠肌中的SNX17可显著改善NMJ处AChR的碎片化形态,减轻肌纤维的病理性损伤,并使EAMG小鼠腿肌无力症状得到一定程度的恢复,揭示了SNX17可能是未来MG治疗的一个新靶点。