研究背景糖尿病是目前严重危害人类健康的全球性疾病之一,是一种由多种病因引起的以高血糖为主要特征的慢性代谢性疾病。糖尿病可引起多种并发症,包括心脑血管疾病、糖尿病肾病、糖尿病足、眼底病变和神经病变等。目前威胁糖尿病患者生命健康最严重的是心血管疾病（cardiovascular disease,CVD）,据统计糖尿病患者最终约50%以上死于心血管病变的各种并发症。美国糖尿病协会和心脏病学会在2014年发布的一项声明指出,与正常人群相比,1型糖尿病患者发生心血管事件时期更早,1型糖尿病患者病程20年后主要的死亡原因是心血管事件,每年的死亡率＞3%。其中,高血压是影响糖尿病患者CVD发病率和患病率的重要因素,而且与2型糖尿病相比,1型糖尿病中高血压更易加重对心血管的损伤。长期以来,摄入食盐过多一直是高血压产生的主要危险因素。临床试验和动物实验均证实糖尿病下肾脏存在排钠障碍现象,而钠-氯同向转运体（Na+-Cl-Cotransporter,NCC）表达的上调可能与此有关。临床上有两种染色体遗传病与NCC功能异常有关:Gitelman综合征和Gordon综合征。Gitelman综合征是指NCC功能丧失导致低钾血症和低血压,Gordon综合征是NCC异常激活导致高钾血症和低肾素性高血压,Gordon综合征又称为家族性高钾血症高血压（FHHt）或者Ⅱ型假性醛固酮减少症。因此NCC在维持机体钠钾稳态和血压平衡中起到重要作用。内向整流钾通道 Kir4.1（Inwardly rectifying potassium channel 4.1,Kir4.1）在醛固酮敏感的远端肾单位（Aldosterone-sensitive distal nephron,ASDN）管周膜侧广泛表达。Kir4.1功能丧失性突变在人类和动物模型上引起低血压、低钾血症和严重的盐耗竭性肾小管病变相关的SeSAME/EAST综合征,这与Gitelman综合征类似。管周膜侧的Kir4.1能够调节远曲小管（Distal convoluted tubule,DCT）上的NCC功能,有助于ASDN对Na+、K+进行精细调控。目前已经发现Kir4.1-NCC通路受多种因素调节,包括钠饮食、钾饮食、血浆激素等,但是其在糖尿病条件下肾钠处理和血压调控过程中的功能意义尚未明确。目的基于以上背景,本研究我们拟利用链脲佐菌素（Streptozotocin,STZ）分别在野生型和肾脏特异性Kir4.1敲除小鼠身上诱导1型糖尿病模型,探究STZ诱导的1型糖尿病小鼠体内NCC激活是否与Kir4.1上调有关,以及敲除Kir4.1是否消除了 STZ小鼠盐敏感性高血压的产生。方法1.1型糖尿病小鼠模型的构建及分组取6周龄C57BL/6J野生型（Wild Type,WT）雄性小鼠,适应性喂养一周后随机分为两组,STZ处理组简称STZ组,对照组简称Vehicle组。（1）Vehicle组,小鼠给予正常的饮食饮水,同时腹腔注射柠檬酸钠缓冲液。（2）STZ组,小鼠夜间禁食但不禁水,时间不超过12小时,腹腔注射STZ-柠檬钠缓冲液（55 mg/kg/day）;STZ造模具体方法:小鼠前一天夜间禁食12个小时,之后腹腔注射STZ-柠檬酸钠缓冲液,一天一次,连续五天,期间给予5%葡萄糖溶液（防止小鼠出现低血糖）。腹腔注射一周后测空腹血糖（禁食6小时）,淘汰空腹血糖低于16.8mM的小鼠,一周之后再测一次空腹血糖,待血糖稳定后用于随后的实验,所有的实验在造模成功后两周之内完成。选择6周龄的肾脏特异性Kir4.1敲除（Ks-Kir4.1 KO）雄性小鼠,在其饮用水中添加多西环素（2mg/ml）,持续两周,停药两周之后进行STZ造模。将Ks-Kir4.1 KO小鼠随机分为2组。（1）Vehicle-Kir4.1 KO组:小鼠给予正常的饮食饮水,同时腹腔注射柠檬酸缓冲液。（2）STZ-Kir4.1 KO组:STZ造模方法同上,STZ造模后每周监测一次空腹血糖,连续2周,淘汰血糖低于16.8 mM的小鼠,所有的实验均在造模成功后两周之内完成。检测Vehicle组和STZ组小鼠空腹血糖及肾小球滤过率。2.检测STZ组小鼠远端肾单位钠转运体表达情况利用蛋白印迹实验（Western Blotting,WB）检测STZ诱导的糖尿病小鼠的钠-氯同向转运体（Na+-Cl-Cotransporter,NCC）、Phosphorylated NCC（pNCC）、钠钾二氯同向转运体（Na+-K+-2Cl-Cotransporter,NKCC2）、Phosphorylated NKCC2（pNKCC2）、上皮钠通道（Epithelial Na+Channel,ENaC）各亚基（α、β、γ）。3.收集高盐饮食前后各组小鼠生理数据分别给予Vehicle组和STZ组小鼠正常盐饮食或者高盐饮食（8%氯化钠）7天,然后利用代谢笼收集小鼠24小时尿液,观察体重、摄食量、摄水量变化情况,检测血浆中的肌酐、尿素氮。4.检测高盐饮食前后各组小鼠血压变化使用无线遥测血压技术监测小鼠动态血压,先观察2-3天基础血压,待血压稳定后给予高盐饮食（8%氯化钠）7天,期间每两天监测一次血压,每次监测小鼠动态血压3小时,从晚上6点至9点。5.检测高盐饮食前后各组小鼠远端肾单位钠转运体表达及活性情况（1）分别给予Vehicle组和STZ组正常盐饮食或者8%高盐饮食7天,利用WB实验检测各组小鼠NCC、NKCC2、ENaC各亚基表达情况。（2）分别给予Vehicle组和STZ组正常盐饮食或者8%高盐饮食7天,利用肾脏清除率实验检测各组小鼠的氢氯噻嗪（Hydrochlorothiazide,HCTZ）诱导的尿钠排泄情况。6.检测高盐饮食前后各组小鼠血浆Na+、K+浓度变化分别给予Vehicle组和STZ组正常盐饮食或者8%高盐饮食7天,检测各组小鼠血浆Na+、K+浓度变化。7.检测高盐饮食前后各组小鼠Kir4.1蛋白表达情况分别给予Vehicle组和STZ组正常盐饮食或者8%高盐饮食7天,检测各组小鼠Kir4.1蛋白表达情况。8.检测Kir4.1敲除后各组小鼠NCC蛋白表达情况检测Vehicle-Kir4.1 KO组和STZ-Kir4.1 KO组小鼠NCC蛋白表达情况。9.检测Kir4.1敲除后高盐饮食对各组小鼠血压的影响分别给予Vehicle-Kir4.1 KO组和STZ-Kir4.1 KO组8%高盐饮食3天,利用无线遥测血压技术检测各组小鼠血压及心率变化情况。10.检测Kir4.1敲除后各组小鼠血浆Na+、K+浓度变化分别给予Vehicle-Kir4.1 KO组和STZ-Kir4.1 KO组8%高盐饮食3天,检测各组小鼠血浆Na+、K+浓度变化。结果1.STZ处理的WT小鼠和Ks-Kir4.1 KO小鼠都有类似的空腹血糖（Fasting bloodglucose,FBG）浓度增加。此外,与对照组相比,STZ诱导的糖尿病小鼠的肾小球滤过率（Glomerular filtration rate,GFR）显著增加。2.WB结果显示,与对照组相比,STZ小鼠肾脏NCC、pNCC、NKCC2、pNKCC2蛋白表达显著增加,而ENaC各亚基蛋白没有明显变化。3.24小时代谢笼实验结果显示,与对照组相比,STZ组的摄食量、摄水量、尿量均有不同程度增加,体重、血肌酐、尿素氮无明显变化。高盐饮食进一步增加了 STZ组小鼠摄水量和尿量,摄食量无显著变化,体重明显减少。4.无线遥测血压实验结果显示,STZ小鼠血压及心率均低于对照组。给予STZ小鼠8%高盐饮食后SBP、DBP、MAP均显著升高,而心率与对照组相比无统计学差异。5.（1）WB结果显示,与对照组相比,STZ组小鼠pNCC、NCC、pNKCC2、NKCC2的蛋白表达均显著上调,ENaC各亚基无明显变化。8%高盐饮食7天能够显著下调对照组小鼠pNCC、NCC、pNKCC2和ENaCγ剪切片段蛋白表达以及STZ组小鼠pNKCC2和ENaCγ剪切片段蛋白表达水平,然而对后者的NCC和NKCC2表达并无明显影响。虽然高盐饮食导致STZ诱导的pNCC蛋白表达水平部分下调,但是其表达仍然高于对照组小鼠（正常盐饮食）。此外,高盐饮食显著下调STZ小鼠pNKCC2蛋白表达,而且其降低幅度远大于pNCC水平（88%vs 25%）。（2）肾脏清除率实验结果显示,随着高盐饮食含量的增加,氢氯噻嗪诱导的尿钠排泄水平在对照组小鼠身上逐步减少,提示体内NCC活性下降。然而,无论是给予STZ小鼠4%或者8%高盐饮食7天均未能显著影响其体内NCC活性。6.4%高盐饮食7天对各组小鼠血浆Na+、K+浓度均无明显影响,而8%高盐饮食7天导致STZ诱导的糖尿病小鼠出现高钠血症。7.WB实验结果显示,STZ处理上调了 Kir4.1蛋白表达水平。8%高盐饮食7天能够抑制对照组小鼠Kir4.1蛋白表达,而对STZ组无显著影响。8.WB实验结果显示,敲除Kir4.1显著降低了 pNCC和NCC蛋白表达,并在很大程度上消除了 STZ处理引起的pNCC和NCC蛋白表达上调。9.敲除Kir4.1可阻止高盐饮食引起的STZ组小鼠血压升高。10.高盐可导致STZ-Kir4.1 KO小鼠出现严重的低钾血症。结论STZ诱导的1型糖尿病小鼠表现为肾脏远曲小管Kir4.1及NCC蛋白表达/活性上调,Kir4.1-NCC通路的失调可能是1型糖尿病小鼠盐敏感性高血压产生的关键因素。