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研究目的 阿霉素（Doxorubicin,DOX）是作为一线抗肿瘤药物,其具有药效强、抗肿瘤谱广的优点,但其心脏毒性危害较大可最终导致心力衰竭。阿霉素诱导心肌毒性的病理机制有多种,其中细胞凋亡被认为是导致心肌损伤的主要因素,但其具体的机制仍不清楚。DEAD-box RNA 解旋酶 3X 连锁（DEAD-box RNA helicase 3 X-linked,DDX3X）,是一种依赖ATP的RNA解旋酶,其在遗传上高度保守并在真核生物中普遍表达,参与调控各种RNA代谢,还参与细胞周期的调控、先天免疫反应、细胞凋亡、癌症发生发展、细胞应激反应等多种重要的生理和病理机制。但DDX3X是否参与阿霉素导致心肌损伤的作用机制尚不清楚。经典的Wnt/β-catenin信号通路在维持器官生长发育和组织稳态中发挥重要作用,其在心肌梗死和缺血再灌注损伤等心血管疾病中还可发挥心脏保护作用。本研究旨在探究DDX3X是否参与阿霉素心肌毒性的病理机制以及是否可以通过调控Wnt/β-catenin信号通路影响阿霉素诱导的心肌损伤。研究方法 1、构建阿霉素诱导心肌毒性的细胞模型并明确DDX3X在阿霉素处理的心肌细胞中的表达情况 使用DOX 2 μM处理H9c2心肌细胞24 h后使用Western blot检测Casp-3和cleaved Casp-3的蛋白水平;使用流式细胞仪检测DOX 2 μM处理的H9c2心肌细胞的凋亡水平;使用DOX 2 μM处理H9c2心肌细胞使用RT-qPCR检测H9c2心肌细胞中DDX3X的mRNA表达水平,Western blot用于检测心肌细胞中DDX3X的蛋白表达情况;2、敲低DDX3X对DOX诱导的心肌细胞损伤的影响 使用DDX3X SiRNA转染心肌细胞以敲低DDX3X,用DOX处理24 h后用Western blot检测DDX3X、Casp-3和cleaved Casp-3的蛋白水平,使用流式细胞仪检测心肌细胞凋亡水平,使用MitoTracker Red CMXRos和Hoechst 33342染色检测心肌细胞线粒体损伤和细胞凋亡水平,使用CCK8检测心肌细胞的活力;3、抑制DDX3X的ATP酶活性对DOX诱导的心肌细胞损伤的影响 使用RK-33（DDX3X的ATP酶抑制剂）预处理H9c2心肌细胞后用DOX处理24 h,使用 Western blot 检测 DDX3X、Casp-3 和 cleaved Casp-3 的蛋白水平,使用 MitoTracker Red CMXRos和Hoechst 33342染色检测心肌细胞线粒体损伤和细胞凋亡水平;4、过表达DDX3X对DOX诱导的心肌细胞损伤的影响 使用Ddx3x plasmids转染H9c2心肌细胞用以过表达DDX3X,使用RT-qPCR检测转染效率;使用Ddx3x plasmids转染H9c2心肌细胞24 h后,再使用DOX 2μM处理24 h,使用Western blot检测DDX3X、Casp-3和cleaved Casp-3的蛋白水平,使用流式细胞仪检测心肌细胞凋亡水平,使用MitoTracker Red CMXRos和Hoechst 33342染色检测心肌线粒体损伤和细胞凋亡水平;5、明确Wnt/β-catenin信号通路在DOX诱导的心肌损伤中的作用以及DDX3X是否通过Wnt/β-catenin信号通路影响DOX诱导的心肌损伤 检测上述不同实验处理条件下心肌细胞中β-catenin蛋白水平;使用DDX3X SiRNA转染H9c2心肌细胞24 h后,使用LiCl（β-catenin激活剂）20 mM处理心肌细胞30 min,再加入 DOX 2 μM 处理 24 h,使用 Western blot 检测的 β-catenin、DDX3X、Casp-3 和cleaved Casp-3 蛋白水平,使用 MitoTracker Red CMXRos 和 Hoechst 33342 染色检测心肌细胞线粒体损伤和细胞凋亡水平。研究结果 1、DDX3X在阿霉素处理的心肌细胞中的表达水平下调 Western blot结果表明,DOX处理后H9c2心肌细胞中的cleaved Casp-3/Casp-3的比值显著增加,即Casp-3蛋白的活化水平增加;流式细胞仪结果表明DOX处理导致H9c2心肌细胞的凋亡率显著增加,表明阿霉素诱导心肌毒性的体外模型构建成功;RT-qPCR和Western blot结果表明DOX处理后的H9c2心肌细胞中DDX3X的表达显著下调。2、敲低DDX3X加重DOX诱导的心肌细胞损伤 Western blot结果表明,DDX3X被敲低后,DOX诱导的心肌细胞中cleaved Casp-3/Casp-3的比值增加;流式细胞仪结果以及MitoTracker Red CMXRos和Hoechst 33342染色结果都表明敲低DDX3X显著加重DOX诱导的心肌细胞凋亡;CCK8的结果也表明DDX3X敲低加重DOX诱导的心肌细胞活力减低。3、抑制DDX3X的ATP酶活性加重DOX诱导的心肌细胞损伤 Western blot结果表明,RK-33预处理不影响DDX3X的蛋白水平,但使DOX诱导的心肌细胞中cleaved Casp-3/Casp-3的比值增加更显著;MitoTracker Red CMXRos和Hoechst 33342染色结果也表明RK-33预处理加重DOX诱导心肌细胞线粒体损伤和细胞凋亡水平。4、过表达DDX3X可减轻DOX诱导的心肌细胞损伤 Western blot结果表明,DDX3X过表达显著逆转DOX诱导的cleaved Casp-3/Casp-3的比值增加;流式细胞仪、Hoechst 33342染色和MitoTracker Red CMXRos和结果也表明DDX3X过表达明显减轻DOX诱导的心肌细胞凋亡和线粒体损伤水平。5、Wnt/β-catenin信号通路在DOX处理的心肌细胞中被抑制以及DDX3X通过激活Wnt/β-catenin信号改善DOX诱导的心肌损伤 Western blot结果表明,DOX处理使的β-catenin蛋白水平下降,敲低DDX3X和RK-33预处理可使DOX诱导的β-catenin蛋白水平下降更甚,DDX3X过表达可部分逆转DOX导致的β-catenin蛋白水平下降;敲低DDX3X后用LiCl预处理可明显逆转DOX处理和DDX3X敲低导致的β-catenin蛋白水平下降、cleaved Casp-3/Casp-3的比值增加以及心肌细胞线粒体损伤和凋亡。结论 本研究首次表明DDX3X参与调控阿霉素诱导的心肌毒性。DDX3X在DOX处理的心肌细胞中的mRNA和蛋白表达水平降低,然而过表达DDX3X可显著地逆转阿霉素诱导的心肌毒性。同时发现Wnt/β-catenin信号在DOX诱导的心肌细胞中被抑制,而使用LiCl激活Wnt/β-catenin信号通路可以减轻DOX导致的心肌细胞损伤和细胞凋亡,而且过表达DDX3X可以使DOX处理的心肌细胞中的β-catenin蛋白水平增加。综上所述,DDX3X可以通过激活Wnt/β-catenin信号通路,促进β-catenin在胞质的稳定和积累,进一步减轻阿霉素诱导的心肌细胞损伤。