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研究背景:心力衰竭（heart failure,HF）是指各种心脏结构或功能性疾病导致心室充盈和（或）射血功能受损,心排血量不能满足机体组织代谢需求,以肺循环和（或）体循环淤血,器官、组织血液灌注不足为临床表现的一组综合征。它是世界范围内引起死亡的其中一个首要病因,具有发病率高、死亡率高的特点。据流行病学调查显示,在总人口数中,平均每100人中就有3到5个有不同程度的心力衰竭,因此心力衰竭是一个非常严重的医疗问题。心脏在外在因素（如高血压或瓣膜病引起的压力或容量负荷过重）和内在因素（如肥厚型心肌病或心肌缺血引起的心脏重塑）的应激下,会发生代偿性肥厚以保证足够的左室射血量以满足机体的需求,但是久而久之,持续存在的慢性压力和基础疾病会使心脏从代偿阶段进入失代偿阶段,此时,心脏会发生心力衰竭不能泵出足够的血液来满足机体的需求,最终引起各种临床表现的发生。因此,病理性心肌肥厚作为心力衰竭的代偿阶段,如果能找到一个治疗靶点来及时有效的延缓甚至逆转病理性心肌肥厚,无疑对心力衰竭的治疗具有重大意义。自噬是细胞内溶酶体参与的自我清除过程,它在进化上十分保守,主要降解长寿蛋白质、大分子物质和一些受损的细胞器等。自噬主要分为三大类:巨自噬、微自噬以及分子伴侣介导的自噬,其中,巨自噬又可分为非选择性自噬和以线粒体自噬为代表的选择性自噬。尽管越来越多的研究表明,自噬在病理性心肌肥厚的发生发展中起着重要的作用,但其中潜在的调控机制还没有被完全阐明。TANK-Binding Kinase 1（TBK1）是IKK激酶家族中的一个丝氨酸/苏氨酸激酶,由于在固有免疫反应中诱导Ⅰ型干扰素产生而被人们熟知。TBK1在身体许多部位都有表达,如:造血组织、心肌、肺和肾等等。以往有研究表明,AMPK能使TBK1磷酸化激活,是TBK1的一个上游分子。此外,其他研究表明,TBK1除了在固有免疫中有重要作用外,对自噬也发挥着重要的调节作用,它能磷酸化自噬受体蛋白p62、OPTN和NDP52等,来增强这些受体一方面与LC3,另一方面与经泛素链修饰的物质的连接能力,从而促进这些物质经自噬途径降解。P62作为TBK1的其中一个下游分子,有报道称TBK1可以磷酸化p62的Ser403位点,从而促进细胞内受损线粒体的自噬降解。虽然,以往研究已表明TBK1在病理性心肌肥厚中具有调节作用,但是由TBK1介导的自噬是否在病理性心肌肥厚中起作用,目前尚不清楚,此外,如果有作用,那么是否是通过AMPK-TBK1-p62通路调节的,目前也不明确。为此,我们在病理性心肌肥厚的体内外模型中,用TBK1的抑制剂或过表达病毒来分别抑制或过表达TBK1,以期观察自噬的变化情况,从而阐明TBK1调控的自噬在病理性心肌肥厚中的具体作用机制,为临床上治疗病理性心肌肥厚和心力衰竭患者提供一个新的治疗靶点和策略。研究目的:本研究旨在阐明TBK1在病理性心肌肥厚中的作用,并探讨其潜在的作用机制,为后续临床研究提供一个新的治疗靶点和策略。研究方法:1.构建TAC诱导的心肌肥厚模型,缩窄主动脉弓。2.抑制TBK1的在体实验:TAC术后,进行灌胃给药TBK1抑制剂amlexanox（30mg/kg/day）四周。3.过表达TBK1的在体实验:TAC术后,小鼠心肌点注射TBK1过表达腺相关病毒。4.四周后超声检测心功能,取材观察心脏大体变化以及测量心重/体重比、心重/胫骨长度比。5.HE染色和WGA染色观察心脏横截面积大小;马松染色和天狼星红染色观察心肌纤维化程度。6.分离大鼠乳鼠原代心肌细胞,给予TBK1抑制剂amlexanox（50μM）或者TBK1过表达腺病毒（MOI=50）处理,随后Ang Ⅱ刺激48h。7.分离大鼠乳鼠原代心肌细胞,给予compound C或AICAR处理,随后Ang Ⅱ刺激48h。8.罗丹明标记的鬼笔环肽染色检测乳鼠心肌细胞面积。9.JC-1染色试剂盒观察线粒体膜电位的变化。10.qPCR检测心肌细胞BNP和β-MHC的变化。11.共聚焦显微镜观察COXIV和LC3、COXIV和p-p62、COXIV和TBK1以及TBK1和p-p62的共定位程度。12.Western Blot检测AMPK、p-AMPK、TBK1、p-TBK1、LC3、p62和p-p62（Ser403）等的变化。研究结果:第一部分:抑制TBK1通过促进自噬改善TAC或Ang Ⅱ引起的心肌肥厚表型1.和Sham组对比,TAC术后,小鼠心功能指标LVEF和LVFS明显降低（p<0.05）而LVEDd和LVESd则明显升高（p<0.05）;在此基础上,加入TBK1抑制剂Amx后,和TAC组对比,LVEF和LVFS升高（p<0.05）而LVEDd和LVESd则降低（p<0.05）。2.和Sham组对比,TAC术后,小鼠心脏体积变大;而加入TBK1抑制剂Amx后,和TAC组对比,小鼠心脏体积变小。3.和Sham组对比,TAC术后,小鼠心重/体重比（HW/BW）和心重/胫骨长度比（HW/TL）明显升高（p<0.05）;而加入TBK1抑制剂Amx后,和TAC组对比,HW/BW和HW/TL比值明显降低（p<0.05）。4.HE和WGA染色结果显示,和Sham组对比,TAC术后,心脏横截面积明显增大（p<0.05）;而加入TBK1抑制剂Amx后,和TAC组对比,心脏横截面积减小（p<0.05）。5.马松和天狼星红染色结果显示,和Sham组对比,TAC术后,心肌纤维化加重（p<0.05）;而加入TBK1抑制剂Amx后,和TAC组对比,心肌纤维化减轻（p<0.05）。6.和CON-DMSO组对比,Ang Ⅱ刺激后,原代心肌细胞面积明显增大（p<0.05）;而加入TBK1抑制剂Amx后,和Ang Ⅱ-DMSO组对比,心肌细胞面积减小（p<0.05）。7.和CON-DMSO组对比,Ang Ⅱ刺激后,原代心肌细胞的线粒体膜电位明显降低（p<0.05）;而加入TBK1抑制剂Amx后,和Ang Ⅱ-DMSO组对比,线粒体膜电位得到改善（p<0.05）。8.qPCR结果显示,和CON-DMSO组对比,Ang Ⅱ刺激后,肥大指标BNP和β-MHC明显升高（p<0.05）;而加入TBK1抑制剂Amx后,和Ang Ⅱ-DMSO组对比,BNP和β-MHC明显降低（p<0.05）。9.Western Blot结果显示,和Sham组对比,TAC术后,p-TBK1和p62明显升高（p<0.05）,LC3明显降低（p<0.05）,而TBK1无明显变化;在此基础上,加入TBK1抑制剂Amx后,和TAC组对比,p-TBK1和p62明显降低（p<0.05）,而LC3和TBK1则无明显变化。Ang Ⅱ刺激的体外模型也表现出同样的结果。第二部分:过表达TBK1通过抑制自噬加重TAC或Ang Ⅱ引起的心肌肥厚表型1.和Sham-NC组对比,小鼠TAC术后,心功能指标LVEF和LVFS显著降低（p<0.05）而LVEDd和LVESd则明显升高（p<0.05）;在此基础上,过表达TBK1后,和TAC-NC组对比,LVEF和LVFS进一步降低（p<0.05）而LVEDd和LVESd则进一步升高（p<0.05）。2.和Sham-NC组对比,TAC术后,小鼠心脏体积变大;而过表达TBK1后,和TAC-NC组对比,小鼠心脏体积进一步变大。3.和Sham-NC组对比,TAC术后,小鼠心重/体重比和心重/胫骨长度比明显升高（p<0.05）;而过表达TBK1后,和TAC-NC组对比,HW/BW和HW/TL比值进一步升高（p<0.05）。4.HE和WGA染色结果显示,和Sham-NC组对比,TAC术后,心脏横截面积明显增大（p<0.05）;而过表达TBK1后,和TAC-NC组对比,心脏横截面积进一步增大（p<0.05）。5.马松和天狼星红染色结果显示,和Sham-NC组对比,TAC术后,心肌纤维化加重（p<0.05）;而过表达TBK1后,和TAC-NC组对比,心肌纤维化进一步加重（p<0.05）。6.和CON-NC组对比,Ang Ⅱ刺激后,原代心肌细胞面积明显增大（p<0.05）;而过表达TBK1后,和Ang Ⅱ-NC组对比,心肌细胞面积进一步增大（p<0.05）。7.和CON-NC组对比,Ang Ⅱ刺激后,原代心肌细胞的线粒体膜电位明显降低（p<0.05）;而过表达TBK1后,和Ang Ⅱ-NC组对比,线粒体膜电位进一步降低（p<0.05）。8.qPCR结果显示,和CON-NC组对比,Ang Ⅱ刺激后,肥大指标BNP明显升高（p<0.05）;而过表达TBK1后,和Ang Ⅱ-NC组对比,BNP水平进一步升高（p<0.05）。9.Western Blot结果显示,和CON-NC组对比,Ang Ⅱ刺激后,p-TBK1和p62明显升高（p<0.05）,LC3明显降低（p<0.05）,而TBK1无明显变化;在此基础上,过表达TBK1后,和Ang Ⅱ-NC组对比,p-TBK1和p62进一步升高（p<0.05）,TBK1过表达明显（p<0.05）,而LC3无明显变化。第三部分:TBK1磷酸化p62（Ser403）诱导的线粒体自噬在病理性心肌肥厚中可能不起作用1.和CON-NC组对比,Ang Ⅱ刺激后,p62蛋白水平升高（p<0.05）,p-p62表达降低（p<0.05）;在此基础上,过表达TBK1后,和Ang Ⅱ-NC组对比,p62蛋白水平进一步升高（p<0.05）,p-p62蛋白水平也升高（p<0.05）。2.和CON-NC组对比,Ang Ⅱ刺激后,COXIV和LC3的共定位指标Pearson系数和Overlap系数均降低（p<0.05）;在此基础上,过表达TBK1后,和Ang Ⅱ-NC组对比,他们的共定位指标升高（p<0.05）。3.和CON-NC组对比,Ang Ⅱ刺激后,COXIV和p-p62的共定位指标Pearson系数和Overlap系数均降低（p<0.05）;在此基础上,过表达TBK1后,和Ang Ⅱ-NC组对比,他们的共定位指标升高（p<0.05）4.和CON-NC组对比,Ang Ⅱ刺激后,COXIV和TBK1的共定位指标Pearson系数和Overlap系数均降低（p<0.05）;在此基础上,过表达TBK1后,和Ang Ⅱ-NC组对比,他们的共定位指标升高（p<0.05）。5.和CON-NC组对比,Ang Ⅱ刺激后,TBK1和p-p62的共定位指标Pearson系数和Overlap系数均降低（p<0.05）;在此基础上,过表达TBK1后,和Ang Ⅱ-NC组对比,他们的共定位指标升高（p<0.05）。第四部分:AMPK-TBK1-p62轴调节Ang Ⅱ引起的心肌细胞肥大1.和CON组对比,Ang Ⅱ刺激后,p-AMPKα、p-TBK1、p62水平明显升高（p<0.05）,LC3表达降低（p<0.05）;在此基础上,加入AMPK抑制剂compound C后,和Ang Ⅱ组对比,p-AMPKα、TBK1、p-TBK1和p62水平降低（p<0.05）,LC3表达升高（p<0.05）。2.和CON-DMSO组对比,Ang Ⅱ刺激后,p-AMPKα、p-TBK1、p62水平明显升高（p<0.05）,LC3表达降低（p<0.05）;在此基础上,加入AMPK激动剂AICAR后,和Ang Ⅱ-DMSO组对比,p-AMPKα、TBK1、p-TBK1和p62水平进一步升高（p<0.05）,LC3无明显变化。3.和CON组对比,Ang Ⅱ刺激后,原代乳鼠心肌细胞的线粒体膜电位明显降低（p<0.05）;而加入AMPK抑制剂compound C后,和Ang Ⅱ组对比,线粒体膜电位得到改善（p<0.05）。4.和CON-DMSO组对比,Ang Ⅱ刺激后,原代乳鼠心肌细胞的线粒体膜电位明显降低（p<0.05）;而加入AMPK激动剂AICAR后,和Ang Ⅱ-DMSO组对比,线粒体膜电位进一步降低（p<0.05）。研究结论:TBK1是病理性心肌肥厚的一个负性调节因子,其潜在作用机制可能是通过AMPK-TBK1-p62通路调节大自噬实现的。