肝癌是我国常见的死亡率较高的恶性肿瘤之一。其侵袭性强、预后差,而且目前对于肝癌的诊断率并不理想,尤其是早期肝癌。但是,早期肝癌的预后好,因此肝癌的早期发现及诊断尤为重要。AFP是目前公认而且最常用的肝癌诊断标志物,但是AFP灵敏度仅为30.9%-75.0%,特异度为63.0%-99.5%。所以,寻找新的灵敏度和特异度更高的肝癌标志物是目前亟待解决的难题。蛋白质组学能通过对全体蛋白质表达的规模化分析,研究生物过程相关蛋白质的动态表达和功能的改变;对于寻找疾病诊断的特异性标志物以及对疾病的发病机理的研究来说,是一种有效的高通量的研究方法,可以获得传统手段无法得到的蛋白标志物,目前已经成为寻找新的肿瘤蛋白标志物的主要方法。与此同时,大多数肿瘤标志物都属于糖蛋白,糖蛋白的糖链(聚糖,glycan)的改变对其结构和功能都有重要影响。糖组学是继基因组学、蛋白质组学之后一门新兴的正日益受到人们关注的学科,利用糖组学技术来发现肝癌的发生过程中血清蛋白糖链的变化,可以为寻找肝癌早期诊断的相关标志物提供重要参考。本研究首先运用蛋白质组学研究方法及手段,通过对正常人、肝炎患者、肝硬化患者及肝癌患者的血清进行差异蛋白质组学分析,筛选出了一些有潜在诊断价值的差异蛋白质,并对其中部分差异蛋白质进行了验证和进一步分析。同时,我们又通过凝集素亲和层析技术对这四组样本进行了凝集素亲和谱的比较,提取了样本的糖谱信息。第一部分肝癌发生过程中血清分子标志物的筛选研究本部分实验主要目的是通过同位素标记相对和绝对定量(iTRAQ)技术结合液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)技术对肝癌发生过程中血清蛋白质组进行动态定量分析,筛选出肝癌发生过程中的差异蛋白质分子标志物,并挑选出具有一定肝癌早期诊断意义的潜在分子标志物。首先,从广西肝癌高发区现场建立的肝癌高危人群队列的人血清标本库中选取四组血清样本,分别是正常对照组、肝炎组、肝硬化组和肝癌组。首先对各实验组去除血清中14种高丰度蛋白,浓缩后再进行稳定同位素iTRAQ试剂标记,经过2次反向色谱柱分离,质谱鉴定,我们共得到316个(95%可信度)蛋白。在这些蛋白中,以邻近时间点蛋白比值>1.2或<0.8,P<0.05,EF<2为差异蛋白筛选标准,共筛选出93个差异蛋白。肝炎组、肝硬化组、肝癌组分别与正常对照组比较有43、70、51个差异蛋白。将所有差异蛋白进行GO分类可知,在细胞定位方面,这些蛋白主要位于细胞外基质(53%)。在生物学过程方面,这些差异蛋白主要参与生物调控(33%)、代谢过程(25%)和免疫反应(14%)等生物学过程。在分子功能方面,这些差异蛋白主要涉及蛋白结合(37%)和酶活性(35%)等方面。对部分差异蛋白(GELS、QSOX1、CD14)进行免疫印迹验证,对CD14进行酶联免疫吸附测定,结果证明质谱结果可靠。最后,通过对各病例AFP值及CD14表达水平进行Logistic回归分析及ROC曲线分析发现,AFP单独诊断肝癌时AUC为0.646,P>0.05,差异无统计学意义,说明本研究中AFP不能诊断肝癌与肝硬化,其Cut-off值为191.4ng/ml时,灵敏度为31.6%,特异度为94.4%;CD14单独诊断肝癌时AUC为0.760,P<0.05,差异有统计学意义,说明CD14具有一定的诊断肝癌与肝硬化的能力,其Cut-off值为3.16ng/ml时,灵敏度为94.7%,特异度为50%;而差异蛋白CD14与AFP联用时,AUC为0.889,P<0.05,差异有统计学意义,ROC曲线下面积明显提高,灵敏度为84.2%,特异度为83.3%,说明两者联用可提高早期肝癌诊断率。以上结果说明本次实验筛查出的肝癌相关差异蛋白CD14,具有一定的诊断肝癌与肝硬化的能力,与AFP联用时可提高早期肝癌诊断率,因此,CD14可能成为诊断早期肝癌的潜在分子标志物。第二部分肝癌发生过程中血清糖蛋白凝集素亲和谱的比较本部分实验主要目的是从糖组学方面利用凝集素亲和层析技术比较肝癌发生过程中凝集素亲和谱的变化。首先,建立一种凝胶基质的凝集素芯片技术,其可行性及准确性已经得到验证。然后应用此种含50种凝集素的芯片技术,对正常对照组、肝炎组、肝硬化组及肝癌组四组样本进行检测,选取在这四组样本中均能检测到的亲和信号增强的凝集素,重复实验三次,发现在三次实验中共同检测到的凝集素共 14 种,分别为 AAL、ACL、ConA、LCA、MPL、NML、PHA-E、PHA-L、PSA、RCA-I、STL、VAL、WGA 和 SNA。说明在肝癌发生过程中患者血清里可能存在增多的岩藻糖、N-乙酰葡糖胺、N-乙酰半乳糖胺、甘露糖、平分型GlcNAc、末端β1-4链接半乳糖等结构。肝癌组与其他组比较,除SNA外,每种凝集素亲和信号强度差异均有统计学意义(P<0.05)。SNA在肝癌组与肝炎组中亲和信号强度差异无统计学意义(P>0.05),通过查找相关文献发现,这可能与唾液酸转移酶活性在急性与慢性病变中大小不同有关。然后从中选取了差异较大的ConA、LCA和PHA-E三种生物素标记的凝集素做凝集素印迹,进一步对芯片结果进行验证,结果显示,凝集素印迹结果与芯片结果一致,说明凝集素芯片结果是可靠的。本部分实验结果表明,肝癌患者血清中含有这些凝集素特异性亲和糖链的蛋白质可能具有潜在诊断价值,为继续寻找肝癌早期诊断的相关标志物提供了重要参考。结论1、通过iTRAQ技术结合LC-MS/MS技术揭示肝癌发生过程中血清蛋白质组学的动态变化,共鉴定出93个差异蛋白。肝炎组、肝硬化组、肝癌组分别与正常对照组比较有43、70、51个差异蛋白。2、CD14单独诊断肝癌时AUC为0.760,P<0.05,说明CD14具有一定的诊断肝硬化与肝癌的能力;CD14与AFP联用时,AUC为0.889,P<0.05,ROC曲线下面积明显提高,说明两者联用可提高早期肝癌诊断率。CD14可以作为诊断早期肝癌的潜在分子标志物。3、通过凝集素芯片技术筛选出14种亲和信号增强的凝集素,含有这些凝集素特异性亲和糖链的蛋白质可能成为诊断早期肝癌的潜在标志物。创新点1、在广西肝癌高发区肝癌高危人群队列筛查和定期复查随访所建立的血清样本和信息库中选取样本作为研究对象,能动态的观察肝癌高危对象的肝癌进程中血清相关指标的变化。2、采用iTRAQ技术结合LC-MS/MS液质联用技术动态分析肝癌发生过程中的血清蛋白质组的表达谱,并发现CD14可能成为早期肝癌的潜在分子标志物。3、建立了肝癌的发生过程的血清凝集素亲和谱。潜在应用价值CD14具有一定的区分诊断肝癌与肝硬化的能力,可能成为潜在的早期肝癌诊断分子标志物。