论文部分内容阅读
白细胞介素15(IL-15)是与白细胞介素2(IL-2)有相似生物学活性，但无序列同源性的新细胞因子，其体内分布远较IL-2广泛，在免疫调节和免疫应答尤其是在抗肿瘤免疫应答中有重要作用。1997年发现的猪白细胞介素15(porcine interleukin-15，pIL-15)是与一种人IL-15活性相似的细胞因子。根据Genbank已发表的猪IL-15基因序列(NM214390)设计并合成了特异性引物，无菌采取荣昌猪前腔静脉血，分离出淋巴细胞，经刀豆蛋白A(ConA)诱导后提取的总RNA为模板，应用RT-PCR方法对猪IL-15基因开放阅读框(ORF)克隆、序列测定及生物信息学分析。结果发现pIL-15 ORF由489个核苷酸组成，推测其编码产物由162个氨基酸组成。核苷酸序列分析比对显示，荣昌猪IL-15与Genbank已发表的pIL-15序列的核苷酸、氨基酸同源性很高，均为99.4％，与人、猕猴、牛、绵羊、犬、猫的核苷酸同源性为84.1％～89.8％，与小鼠的同源性为77.4％，与鸡的同源性仅为27.8％，与人、猕猴、牛、绵羊氨基酸同源性均在80.0％以上，与鸡的同源性仅为34.8％。结构域分析发现，pIL-15与pIL-2结构有很大的相似性。系统进化树则表明猪IL-15与哺乳动物亲缘关系较近，与鸡进化关系较远。研究发现，IL-15的分泌受到多种因素的调控。其中，IL-15的长信号肽是影响IL-15蛋白分泌的主要因素，本实验借鉴人IL-15体外表达的经验，除去了含有48个氨基酸残基的信号肽。应用PCR技术扩增出荣昌猪IL-15成熟肽基因，进行pMD18-T载体克隆，通过对质粒pMD18-T-IL-15及pET-32a(+)进行EcoRⅠ、XhoⅠ双酶切、连接，将pIL-15基因定向插入pET-32a(+)，经双酶切和PCR鉴定表明，成功构建重组表达质粒pET-32-pIL-15，并转化入表达宿主菌BL21(DE3)，用IPTG进行诱导表达，SDS-PAGE分析表明，表达产物以融合表达的包涵体形式存在，大小约34KD，表达的融合蛋白约占菌体总蛋白的39.3％左右。对表达条件进行优化，确定最佳表达条件为IPTG 0.4mmol／L，诱导4h。融合表达的猪IL-15包涵体经初步纯化、复性后采用MTT法检测其生物学活性，结果表明所获得的重组猪IL-15具有较高的促猪外周血淋巴细胞增殖反应活性，具有较强的生物学活性。这为进一步研究猪IL-15生物学活性和应用奠定了基础。