【摘 要】
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细胞质雄性不育（Cytoplasmic male sterility,CMS）系统是甘蓝型油菜杂种优势利用的重要途径。利用该系统易于获得全不育群体,降低杂交制种的成本,有利于杂交种在生产上普及应用。从萝卜中发现的Ogu CMS具有不育性稳定、彻底,被成功转育到甘蓝型油菜后,被认为是油菜杂种优势利用最理想的细胞质不育类型。但该类型胞质不育的恢复源仅存在于萝卜中,而直接利用萝卜转育甘蓝型油菜Ogu C
【基金项目】
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国家自然科学基金（31401467）； 湖南省自然科学基金（14JJ6053）； 湖南省农业科技创新资金（2019YC02）； 湖南省科技重点研发计划（2016NK2200）； 华中农业大学国家作物遗传改良国家重点实验室开放课题（2662020ZKPY019）；
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细胞质雄性不育（Cytoplasmic male sterility,CMS）系统是甘蓝型油菜杂种优势利用的重要途径。利用该系统易于获得全不育群体,降低杂交制种的成本,有利于杂交种在生产上普及应用。从萝卜中发现的Ogu CMS具有不育性稳定、彻底,被成功转育到甘蓝型油菜后,被认为是油菜杂种优势利用最理想的细胞质不育类型。但该类型胞质不育的恢复源仅存在于萝卜中,而直接利用萝卜转育甘蓝型油菜Ogu CMS恢复系非常困难。本研究以湖南省作物研究所通过利用桥梁种萝卜芸薹（AACCRR）创制的甘蓝型油菜Ogu CMS恢复材料CLR650为供试材料,通过多代单株自交选择,获得了表型和育性稳定的恢复系CLR6430,并利用BAC文库技术和基因组重测序技术,对CLR6430中的恢复基因及其旁侧外源萝卜DNA序列信息进行分析,开发了一系列恢复基因及外源DNA片段的特异标记,并培育出品质和性状得到显著改良的Ogu CMS恢复系1份。获得的主要研究结果如下:1.根尖体细胞染色体计数结果表明,CLR6430体细胞染色体为38条;以Copy Control?p CC1BAC?（Hind III Cloning-Ready）Vector为载体构建了CLR6430的基因组文库,并利用萝卜基因组和制备的Ogu CMS恢复基因BAC探针,对CLR6430的花药细胞染色体组进行原位杂交,结果表明CLR6430中无完整的萝卜染色体杂交信号,在A染色体组中检测到1对Ogu CMS恢复基因BAC探针杂交信号,说明外源萝卜片段位于CLR6430的A染色体组,位置与R2000不同。2.利用CLR6430与Ogu-CMS不育系20QA（保持系20B）、SC3QA（保持系SC3）构建的F2、F3自交分离群体以及正向回交S（rfrf）×S（Rfrf）、反向回交S（Rfrf）×N（rfrf）的BC1F1、BC2F1回交分离群体,结果在F2、F3分离群体中可育与不育株的比例均不符合1对显性基因控制的3:1分离比,在正、反交BC1F1、BC2F1分离群体中可育与不育株的比例均不符合1对显性基因控制的1:1分离比,说明CLR6430中的恢复基因在后代中存在偏分离遗传现象,且通过雌、雄配子传递给后代的机率相同。利用已公布的Ogu CMS恢复基因Rfo特异标记分析F2和BC1F1分离群体单株,结果表明恢复基因特异标记与育性存在共分离表现。3.将CLR6430基因组重测序的reads与Ogu CMS恢复基因Rfo所在127Kb序列（Gene Bank:AJ550021.2）进行比对,结果127Kb的覆盖度为99.83%,说明CLR6430中的恢复基因为Rfo基因;进一步将127Kb序列与萝卜基因组（Scaffold水平）进行比对,结果在萝卜基因组R9连锁群Rs＿scaf131上存在1个高度同源的区域;将CLR6430基因组重测序组装的contigs,与甘蓝型油菜基因组和Rs＿scaf131进行比对,通过比对区间identity、比对方向和位置等过滤后,发现在甘蓝型油菜Chr A6上1个同源contig中存在与Rs＿scaf131部分序列同源的区域,该contig可能含有恢复基因所在的127Kb部分序列。4.以萝卜基因组的R9连锁群所有Scaffolds序列为参考,设计了扩增位点覆盖R9连锁群的100对特异引物,通过引物筛选和分离群体验证,获得32个外源萝卜片段特异标记,位置分布于R9连锁群体的66.13～138.23 c M的区域,利用其他区域设计的引物均无扩增产物或者扩增产物为共分离,推测CLR6430中外源萝卜片段大小相当于萝卜R9连锁群的72.4c M的长度。5.利用32个外源萝卜片段特异标记对CLR6430和R2000进行PCR扩增和产物测序,结果表明CLR6430的PCR扩增片段大小和序列均与R2000存在差异。6.以甘蓝型油菜“双低”品系为轮回父本,经过MAS回交选择+混合选择,培育出1个新的甘蓝型油菜Ogura CMS恢复系CLR095,其细胞质为Ogu CMS不育胞质,自交和测交后代的育性均正常;该恢复系表型性状显著优于CLR6430和CLR650,其种子硫代葡萄糖苷含量降低到68.7μmol/g（饼粕）,但仍远高于轮回亲本。利用硫代葡萄糖苷基因的连锁标记对CLR650、CLR6430和CLR095进行分析,结果表明该3个恢复材料中均能扩增出大小相同的PCR产物,说明其恢复基因Rfo与硫代葡糖糖苷基因位点间遗传连锁未能通过回交和自交同源重组打破。国外对利用细胞融合和胚拯救技术成功转育的油菜Ogu CMS恢复源及改良技术实施了长期专利保护,我国由于缺乏自主创新的恢复源,油菜Ogu CMS杂种优势利用未实现“三系”配套。本研究结果不仅阐明了CLR650新颖性和独创性,而且成功对该材料进行了遗传改良,为我国油菜Ogu CMS杂种优势利用的研究和应用提供了新的恢复系。
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