微孢子虫(Microsporidia)是一类专性细胞内寄生的单细胞真核微生物,分布极其广泛,几乎可以寄生在包括人在内的所有脊椎动物与无脊椎动物中。家蚕微粒子(Nosema bombycis,N.b)是第一个被鉴定的微孢子虫,能够感染家蚕(Bombyx mori)引起家蚕微粒子病(Pébrine),给蚕业造成重大的经济损失。当前防控家蚕微粒子的手段主要有:母蛾镜检淘汰有毒蚕种、饲养过程中严格消毒处理、感染后通过防微灵及阿苯达唑等化学药物治疗。由于家蚕微粒子的结构特殊,现有治疗药物效果尚不稳定,一直以来家蚕微粒子的防治工作以预防为主。但是现有的预防措施也很难达到一个理想的效果,迫切需要研发一种新型高效的防控方法。纳米银(Ag nanoparticles,AgNPs)是粒径为纳米级的金属银单质,由于其独特的表面效应、体积效应、量子尺寸效应和宏观隧道效应等,已广泛应用于化工、纺织、电子、生命科学和医学等研究领域,并呈现出极其重要的应用价值。纳米银具有广谱的抗菌特性,抗菌效果持久,且不易产生耐药性,能够有效的杀灭细菌、真菌和支原体等致病微生物。本研究为了探究纳米银对家蚕病原微生物尤其家蚕微粒子是否具有抑制作用以及对家蚕微粒子的作用机制,进行了相关研究,并获得以下研究结果:1.纳米银对家蚕生长发育的影响通过透射电子显微镜观察到纳米银呈球形,大小在3~24 nm,主要集中分布在3~18 nm,晶格条纹间距为0.23 nm。家蚕BmN-SWU1细胞增殖活力实验表明,12μg/m L浓度以下的纳米银不影响家蚕细胞的增殖活力。进一步选取1μg/m L、10μg/mL、25μg/m L、50μg/m L和100μg/m L五个浓度纳米银,对家蚕幼虫的毒性进行测试,结果显示各组之间家蚕幼虫体重、全茧量、茧层量、茧层率以及产卵数均没有显著差异,表明100μg/mL以下浓度的纳米银对家蚕幼虫安全。2.纳米银对家蚕主要病原的抑制作用家蚕病原微生物包括病毒、细菌以及真菌,其中家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV)以及家蚕微粒子危害最为严重,本研究选择二者以及几种代表性细菌作为纳米银抑制家蚕病原微生物的研究对象。首先鉴定纳米银对BmNPV的抑制作用,个体水平上通过qRT-PCR分析发现,纳米银作用后病毒基因的表达量维持在一个较低水平;存活率统计结果显示,纳米银处理后显著提高了家蚕的存活率。纳米银对家蚕病原细菌的抑制作用检测结果表明,25μg/m L以上浓度的纳米银能够完全抑制灵菌、苏芸金杆菌和黑胸败血病菌的生长繁殖。进而对纳米银抑制家蚕微粒子的作用进行检测,统计感染家蚕微粒子后的家蚕存活率发现,纳米银作用后能提高家蚕存活率,100μg/m L的纳米银作用后在第十天时家蚕存活率高达90%,此时正常感染家蚕微粒子的家蚕存活率仅20%。qRT-PCR结果分析发现,家蚕微粒子的拷贝数低于对照组,且随纳米银作用浓度的升高而显著降低,证明了纳米银能够抑制家蚕微粒子的增殖。以上结果表明纳米银对BmNPV、家蚕细菌以及家蚕微粒子均有抑制作用,对家蚕病原微生物具有广谱抗性。3.纳米银对家蚕微粒子的作用机制探究综合家蚕病原微生物的防控现状,选取家蚕微粒子作为主要研究对象,探究纳米银对家蚕微粒子的作用机制。纳米银作用家蚕微粒子后经人工发芽处理发现,纳米银浓度越高,家蚕微粒子的发芽率越低,从而影响了家蚕微粒子的侵染能力。通过透射电子显微镜观察家蚕微粒子的结构发现,纳米银处理后,家蚕微粒子的刺突状孢子外壁变得光滑,具有透明电子层的孢子内壁变厚,孢子内部结构如细胞核、细胞器、发芽装置等变得极其紊乱。进而通过扫描电子显微镜观察发现,纳米银在接触到家蚕微粒子后便迅速作用于孢壁,随着时间的延长,部分家蚕微粒子出现破裂干瘪的现象。对纳米银处理后的家蚕微粒子的细胞核进行染色以及qRT-PCR检测,发现其核物质被释放出来;对家蚕微粒子的总蛋白检测结果表明,纳米银处理使家蚕微粒子释放出大量蛋白质,导致家蚕微粒子蛋白质严重变性降解。综合以上结果表明,纳米银会严重破坏家蚕微粒子的结构,与孢壁作用增加其通透性,从而被破坏的一些DNA以及蛋白质等其他物质被释放出来,使其侵染能力大大削弱,降低了家蚕微粒子的致病能力。