虾青素是具有抗氧化、抗炎及免疫调节功能的一种类胡萝卜素,广泛分布在自然界中,在食品、医疗、及化妆品行业具有很大的发展前景及应用需求。大肠杆菌作为一类结构简单且易于操作的原核生物,可作为虾青素异源表达的宿主。目前虾青素的异源改造工程基本是对β-胡萝卜素酮基化酶（CrtW）和β-胡萝卜素羟基化酶（CrtZ）两个合成酶进行筛选,从而实现虾青素合成途径的优化。虾青素作为一类疏水性萜类化合物,通常在膜组分中积累,理论上可以通过将酶定位到底物附近的策略提高催化效率,增加虾青素产量。本研究采用CRISPR/dCas9技术,将大肠杆菌虾青素途径中的β-胡萝卜素酮基化酶和β-胡萝卜素羟基化酶定位至细胞膜附近,减少底物与酶的距离,从而提高虾青素产量。本研究构建了一种新型分子装置,将dCas9与内膜蛋白Glp F融合,形成dCas9融合定位标签（dCas9-Lag）,dCas9-Lag可在g RNA的作用下实现对目标序列的定位作用。将CrtW和CrtZ基因表达质粒分别与dCas9-Lag及相应gRNA共转入大肠杆菌,检测到实验组角黄素的产量为2.92mg/L,单位细胞的角黄素产量为0.54mg/g DCW,比对照菌株分别提高了14.0%和17.4%。实验组玉米黄素的产量为4.50mg/L,单位细胞玉米黄素产量为0.89mg/g DCW,与对照组相比分别提高了18.8%和29%。实验组和对照组的生长状态与质粒稳定性无明显差异,证明该改造对宿主生长无影响。经过荧光观察,证明dCas9-Lag能够与目的基因结合,膜组分的质谱分析表明膜组分中β-胡萝卜素羟基化酶的含量有所提高。通过透射电镜观察,发现实验组的染色体某些位置更靠近细胞膜,表明dCas9-Lag可能使靶点DNA定位到细胞膜附近。随后将CrtW和CrtZ基因的串联表达质粒与dCas9-Lag及g RNA共转入宿主细胞,检测到虾青素的产量为0.41mg/L,单位细胞的虾青素产量为0.20mg/g DCW,与对照菌株相比分别提高了26.7%和24.2%,证明dCas9-Lag可以提高虾青素产量。本研究设计了一种新型分子装置（dCas9-Lag）,对大肠杆菌中虾青素途径合成酶进行定位,将酶定位到细胞膜附近,从而提高相应代谢产物的产量。该技术为虾青素代谢途径的改造提供了一种新的优化方法,也为类胡萝卜素等疏水类化合物的代谢途径改造提供一种新方案。