论文部分内容阅读
胫骨软骨发育不良(Tibial Dyschondroplasia,TD)是肉鸡常发的一种骨骼疾病。禽TD主要病理特征是:生长板处形成无血管无钙化的白色软骨栓,生长板处的血管大量缺乏等。研究表明,血管缺乏和软骨细胞钙化不足是导致TD发生的主要原因。其中血管缺乏会导致细胞内的营养成分和氧含量下降,分化也会受到干扰,影响软骨细胞正常发育。血管内皮生长因子(VEGF)和缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)是生长板血管生成的关键因素;而Wnt/β-catenin是软骨细胞增殖、分化的关键因素。肉鸡TD临床症状表现为体重降低、采食量下降、站立不稳、行走困难、腿骨变形、双侧膝关节肿胀、严重者出现瘫痪等,这些都严重影响家禽业的发展。牛磺酸是在多数哺乳动物组织中发现的一种非蛋白质含硫氨基酸,具有多种功能,如调节线粒体蛋白质合成、抗氧化活性、解毒、胆汁酸结合、渗透调节、细胞增殖、和抗凋亡等。先前的研究表明,牛磺酸通过ERK信号通路激活成骨细胞中CTGF的表达,证明了牛磺酸与骨稳态之间的直接联系。除此之外,牛磺酸还与老年笼养蛋鸡的股骨和胫骨的骨密度有关。牛磺酸的这些有益特性表明它可能对骨稳态有一定的作用,但其作用于肉鸡TD的作用尚不清楚。于是,本试验选择VEGFA、HIF-1α和Wnt/β-catenin信号通路验证牛磺酸对福美双分别在体内和体外诱导肉鸡胫骨软骨发育不良和软骨细胞损伤的影响。体内试验,购买150只AA肉鸡并分为三组:Control group、TD group和Treatment group。1至3天为适应期,淘汰差异显著个体,使每组肉鸡为40只。Control group肉鸡一直处于正常条件下饲养。TD group和Treatment group在第4至7天以50 mg/kg的剂量给予含有福美双的饲料进行造模处理,然后在第8至18天恢复正常饮食,同时Treatment group给予含有0.1%牛磺酸饮水。在第7、10、14和18天进行取样。试验过程中进行观察并记录相关数据,观察肉鸡临床症状、记录肉鸡体重和日采食量等,最后检测与血管和软骨细胞发育相关的蛋白和基因的表达,探究牛磺酸对肉鸡TD的影响。体外试验,购买50只AA肉鸡并在正常条件下饲养,选取第9至18天AA肉鸡进行原代软骨细胞培养。试验分为四组:Control group、TD group、Treatment group和Taurine group。试验过程中进行观察并记录相关数据,观察软骨细胞的生长状态,最后检测与血管和软骨细胞发育相关的蛋白和基因的表达,探究牛磺酸对软骨细胞的影响。研究结果如下:1.体内试验结果(1)牛磺酸对肉鸡TD临床症状、病理结构及生长性能的影响肉鸡经福美双诱导之后,临床症状表现为:体重降低、采食量下降、站立不稳、行走困难、腿骨变形、双侧膝关节肿胀等。经牛磺酸治疗之后,肉鸡TD症状逐渐改善,可以正常行走,肉鸡TD体重增加,且采食量降低,获得更好的料肉比。除此之外,研究发现牛磺酸还能恢复肉鸡TD的胫骨重量、长度及生长板宽度。(2)牛磺酸对肉鸡TD生长板中血管的影响对生长板进行HE染色、免疫荧光试验、RT-q PCR以及Western blot方法检测,发现肉鸡TD生长板处血管缺乏、短,且不能正常侵入到生长板中,生长板中的HIF-1α、VEGFA表达量增多。牛磺酸处理之后,肉鸡TD生长板处的血管明显增多、逐渐恢复正常,并能正常侵入到生长板中。此外,生长板中的HIF-1α、VEGFA表达量降低。(3)牛磺酸对肉鸡TD生长板中软骨细胞的影响对生长板进行HE染色、免疫荧光试验、RT-q PCR以及Western blot方法检测,发现肉鸡TD生长板处软骨细胞排列不规则,细胞核溶解、细胞变形,生长板中的β-catenin表达量增多而GSK-3β的表达量降低。牛磺酸处理之后,肉鸡TD生长板处的软骨细胞排列规则、细胞形态完整,生长板中的β-catenin表达量降低,GSK-3β的表达量增高。说明牛磺酸能减少β-catenin过度表达,减少肥大细胞的聚集,缓解TD症状。2.体外试验结果(1)牛磺酸对软骨细胞形态、生长的影响软骨细胞经含有福美双的培养基诱导之后,软骨细胞皱缩、变形,增殖和分化能力降低。经含有牛磺酸的培养基处理之后,软骨细胞的形态恢复正常,增殖和分化能力增强。另外,发现Treatment group和Taurine group的细胞活性高于Control group的,说明牛磺酸具有促进软骨细胞增殖的能力。(2)牛磺酸对软骨细胞中血管相关因子的影响对生长板进行免疫荧光试验、RT-q PCR以及Western blot方法检测,研究发现TD group中HIF-1α、VEGFA表达量降低。经牛磺酸处理之后,Treatment group中HIF-1α、VEGFA表达水平增高。另外,与Control group相比,Taurine group HIF-1α和VEGFA基因和蛋白的表达显著升高。说明福美双能抑制软骨细胞产生HIF-1α、VEGFA使软骨细胞活性降低,而牛磺酸能提高软骨细胞产生HIF-1α、VEGFA的活性。(3)牛磺酸对软骨细胞中增殖、分化相关因子的影响对生长板进行免疫荧光试验、RT-q PCR以及Western blot方法检测,研究发现TD group中β-catenin表达量降低而GSK-3β的表达量增高。经牛磺酸处理之后,Treatment group中β-catenin表达量增多,GSK-3β的表达量降低。Taurine groupβ-catenin基因和蛋白的表达显著高于Control group。表明福美双能抑制软骨细胞产生β-catenin使软骨细胞增殖、分化能力降低,而牛磺酸通过促进软骨细胞产生β-catenin,进而使软骨细胞增殖、分化能力提高。本试验成功的验证了牛磺酸对肉鸡体内胫骨软骨发育不良和体外软骨细胞损伤的治疗作用,并证实了牛磺酸可能是通过影响血管发育和软骨细胞增殖、分化来改善肉鸡TD的症状、生产性能及软骨细胞活性等。牛磺酸不仅成本低,而且具有促进生长的作用,本次研究为治疗肉鸡TD提供一种安全、有效、低成本和促进生长的药物。