论文部分内容阅读
背景和目的：高糖可造成足细胞发生一系列损伤,包括足细胞向间充质细胞转分化,足细胞活力下降,凋亡增加等。糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3p,GSK-3p)在足细胞中含量丰富,功能多样,参与了包括细胞黏附、转分化、凋亡、迁移等多种病理生理过程。有研究发现GSK-3β抑制剂可诱导皮肤上皮细胞发生转分化,亦有研究表明GSK-3β抑制剂可减少高糖条件下肾小球系膜细胞的凋亡。说明目前对于GSK-3p抑制剂的作用还存在争议。那么对于高糖刺激条件下的足细胞,GSK-3β抑制剂有无保护作用,及GSK-3β活性改变对高糖导致足细胞损伤的意义尚不清楚。本实验拟利用RT-PCR、Western blot检测足细胞标记蛋白和凋亡相关基因的表达变化,并利用流式细胞术及MTT法检测足细胞足细胞活力变化及凋亡情况,观察GSK-3p在高糖导致的足细胞转分化和凋亡过程中的作用,及GSK-3p抑制剂对高糖损伤足细胞的意义。方法33℃许可条件下用含10%胎牛血清的RPM11640培养基培养条件永生化小鼠足细胞系,并在37-C非许可条件下培养14天诱导其分化,Western blot检测Synaptopodin鉴定其分化成熟,将分化成熟的足细胞分为4组,(1)正常糖浓度组,足细胞培养基含葡萄糖5.6mmol/L,(2)高糖组,足细胞培养基含葡萄糖30mmol/L,(3)LiCl组,足细胞培养基含LiCl10mmol/L,(4)高糖+LiCl组,足细胞培养基含葡萄糖30mmol/L, LiCl10mmol/L,48小时后MTT法检测足细胞存活率,RT-PCR检测Bcl-2、Bax的mRNA水平,流式细胞术检测足细胞凋亡率,Western-blot检测nephrin、α-SMA蛋白的表达。结果1. 37℃非许可条件下培养14天,显微镜下观察分化成熟的足细胞呈星形多突状,核圆形,从胞体伸出很多突起,可见次级足突,Western-blot检测分化成熟足细胞Synaptopodin表达阳性。2.按上述分组培养足细胞48小时,MTF法检测足细胞存活率,高糖组、高糖+LiCl组均较正常组明显下降(P<0.05),LiC1组较正常组下降(P<0.05),高糖+LiC1组较高糖组存活率下降(P<0.05)。3. RT-PCR检测Bcl-2mRNA水平,高糖组.LiC1组较正常组下降(P<0.05),高糖+LiC1组基本无表达；Bax mRNA表达水平,高糖组、LiC1组较正常组增加(p<0.05),高糖+LiC1组较正常组、高糖组明显增加(p<0.05)。4.流式细胞术检测足细胞凋亡率,高糖组较正常组增加(P<0.05), LiC1组较正常组无明显差异(P>0.05),高糖+LiCl组较高糖组明显增加(P<0.05)。5. Western-blot检测nephrin表达,高糖组、高糖+LiC1组、LiC1组均较正常组明显减少(P<0.05),高糖+LiCl组与高糖组相比表达进一步下降(P<0.05); α-SMA表达,高糖组、高糖+LiC1组、LiC1组均较正常组明显增多(P<0.05),高糖+LiC1组与高糖组相比表达增多(P<0.05),差异有统计学意义(P<0.05)。结论1.高糖导致足细胞生存活力下降,GSK-3p抑制剂LiC1使高糖环境下的足细胞活力进一步下降。2.高糖可诱导足细胞凋亡,使抑凋亡基因Bcl-2mRNA表达减少,促凋亡基因Bax mRNA表达增加,GSK-3β抑制剂在高糖基础上使上述改变更明显。3.GSK-3β抑制剂可使足细胞发生转分化,使高糖诱导的转分化程度加深。