【摘 要】
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瘤背石磺（Onchidium reevesii）是一种两栖性滩涂贝类,主要分布在我国东南沿海海岸的潮上带区域,具有较高的经济价值。瘤背石磺栖息在潮间带中,在被潮汐淹没阶段会遭受氧气的剥夺,时常处于暂时性缺氧状态,但瘤背石磺保持了正常的生理活动。因此我们探究瘤背石磺应对氧气供应减少的生存策略。然而,据我们所知,在分子和生理水平上都缺乏对该物种的低氧耐受性研究。为探究瘤背石磺在低氧环境中的生存机制,本
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瘤背石磺（Onchidium reevesii）是一种两栖性滩涂贝类,主要分布在我国东南沿海海岸的潮上带区域,具有较高的经济价值。瘤背石磺栖息在潮间带中,在被潮汐淹没阶段会遭受氧气的剥夺,时常处于暂时性缺氧状态,但瘤背石磺保持了正常的生理活动。因此我们探究瘤背石磺应对氧气供应减少的生存策略。然而,据我们所知,在分子和生理水平上都缺乏对该物种的低氧耐受性研究。为探究瘤背石磺在低氧环境中的生存机制,本实验研究了瘤背石磺生理生化指标,包括能量代谢指标:葡萄糖、肝糖原和乳酸;抗氧化指标:过氧化氢酶（CAT）、还原型谷胱甘肽（GSH）和丙二醛（MDA）;免疫指标:谷草转氨酶（AST）和谷丙转氨酶（ALT）。本研究克隆了瘤背石磺OrPHD2基因,对该基因进行了生物信息学分析,并研究了瘤背石磺面对低氧胁迫时体内相关低氧诱导基因的表达情况。1、低氧胁迫对瘤背石磺生理生化的影响为探究低氧胁迫对瘤背石磺能量代谢、氧化应激和免疫功能的影响,本实验在低氧条件[DO为（2.0±0.2）mg/L]下分别测定了0、4、8、12和24 h时血清和肝胰腺生化指标的变化。实验结果显示,在能量代谢指标中,血清血糖、肝糖原、血清和肝胰腺中乳酸的含量随着低氧胁迫时间的推移均显著上升。在抗氧化指标中,过氧化氢酶（CAT）活性和还原型谷胱甘肽（GSH）含量呈先上升后下降的变化趋势,二者均在8 h时达到最大值,与对照组相比,显著高于对照组（P＜0.05）;脂质过氧化物丙二醛（MDA）的含量随着低氧胁迫时间的推移呈逐渐上升趋势,与对照组相比,显著高于对照组（P＜0.05）。在免疫指标中,谷丙转氨酶（ALT）和谷草转氨酶（AST）呈波动上升的变化趋势,与对照组相比,均显著高于对照组（P＜0.05）,并且从8 h开始血清中ALT和AST的含量开始高于肝胰腺ALT和AST的含量,表明瘤背石磺的肝胰腺受到了一定程度的组织损伤。该实验表明,瘤背石磺为适应低氧环境,机体主要进行无氧糖酵解代谢,而且低氧胁迫会影响机体的抗氧化能力和免疫功能。2、OrPHD2基因的克隆及生物信息学分析瘤背石磺OrPHD2基因全长3066 bp。5’端非编码区长473 bp,3’端非编码区长412 bp;开放阅读框（ORF）长1482 bp,编码493个氨基酸。分子质量为54.51607 Ku,理论PI为7.15。该蛋白氨基酸组成中,Ser（丝氨酸）和Ala（丙氨酸）所占比例较高。无信号肽,属于跨膜蛋白。OrPHD2序列编码区在267-454aa处有一个P4Hc结构域。磷酸化位点55个,可以起到修饰蛋白质的作用,发挥特定功能。通过同源性分析并构建进化树,结果显示,瘤背石磺OrPHD2与加州海兔（Aplysia californica）的进化关系最近。3、低氧胁迫对瘤背石磺OrPHD2表达量的影响对基因OrPHD2 m RNA在瘤背石磺各个组织的表达量进行分析,实验结果表明,OrPHD2在各组织上均有一定的表达,肝胰腺、口器和肌肉表达量较多,其中在肝胰腺中表达量最高。为探究该基因在低氧下的表达情况,以表达量较高的肝胰腺、口器和肌肉组织为分析对象设计低氧胁迫实验。结果显示,基因OrPHD2在肝胰腺、口器和肌肉中的表达量均呈先上升后下降的变化趋势。随着低氧时间的持续,依次在肝胰腺、口器和肌肉表现出表达量最高,说明肝胰腺对环境刺激最灵敏。OrPHD2的表达模式展现出显著的时间性和空间性,因此推测OrPHD2在瘤背石磺遭受低氧胁迫期间在特定组织中发挥作用以提高机体的适应能力。4、低氧胁迫对低氧诱导基因表达量的影响肝胰腺是低氧应答基因OrPHD2首次感应氧气浓度变化并做出反应的组织,因此分析低氧诱导基因糖原磷酸化酶（GP）、谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）和热休克蛋白70（Hsp70）在瘤背石磺肝胰腺的表达情况。实验结果显示,随着低氧胁迫时间的推移,瘤背石磺肝胰腺糖原磷酸化酶（GP）m RNA的表达量显著上调（P＜0.05）,说明该基因受低氧压力刺激被转录激活。GPx m RNA和热休克蛋Hsp70 m RNA的表达量呈先上升后下降的变化趋势,两者均在8 h时达到最大值（P＜0.05）,表明GPx和Hsp70既可以被低氧激活,也可以在一定程度上受到抑制。与本文对生理生化指标的研究内容同时分析,发现GP的表达与肝糖原的变化恰好呈相反趋势,GPx和Hsp70的变化趋势则与GSH和CAT相似。从基因表达水平对生化指标水平进行印证,表明基因的转录对蛋白表达是至关重要且联系密切的。
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