目的：白细胞介素-12(IL-12)能促进NK细胞和T细胞的增殖、活化及细胞毒作用；促进巨噬细胞的活化和多种细胞因子的产生；调节Th0细胞向Th1细胞分化发育，增强细胞免疫功能。诸多生物学功能显示，IL-12在抗肿瘤免疫中发挥着重要的作用。体内直接注射IL-12蛋白因其较强的毒副作用限制了其临床应用，IL-12质粒DNA直接注入体内可在局部细胞表达分泌，使局部组织积聚高浓度的IL-12，改善肿瘤的微环境，激发抗肿瘤免疫应答，且血清中的IL-12较低，避免了全身性的毒副作用。某些药物如环磷酰胺(CY)、阿霉素(DOX)、丝裂霉素C(Mit-C)等在一定剂量范围内对免疫功能无明显抑制，甚至可以增强免疫功能。本文旨在观察联合应用mIL-12质粒和小剂量环磷酰胺治疗黑色素瘤的效果以及对小鼠NK和巨噬细胞功能的影响，为寻找基因治疗和化疗的联合治疗方法作一初步探索。 材料和方法：动物：C57BL／6小鼠，雄性，6～8周龄；细胞株及质粒：白血病细胞株L1210、Yac-1、B16细胞株由浙江大学免疫 浙江大学硕士学位论文 学研究所常规传代培养和保存，鼠臼细胞介素＊ 双亚基共表达质 粒巾CmIL二）由本所构建、保存；质粒大量制备及纯化：用碱 裂解法大量提取质粒，酚：氯仿：异戊醇（25：24）纯化；小 鼠实验分组方案：收集处于对数生长期的＊ 细胞，每只小鼠左 后腿皮下k．d注射 0．linl，浓度 IX 10‘／ml；24小时后随机分为 4 组：A组（联合组人于第L 4、6天每只肌肉注射（i．m） pCmIL一 质粒 100 卜g，背部皮内注射（i．d） CY 00卜l；B组（ pCmIL一 12 组）： 于第2、4、6天每只肌肉注pCmILl 质粒100卜g；C组KY组人 于第 2、4、6天背部皮内注射 CY 00…；D组（对照组人肌肉注 射和皮下注射生理盐水 100pl。检测方法：第 15天时处死小鼠， 称量肿瘤；小鼠自然杀伤（NK）细胞活性和巨噬细胞杀伤活性采 用 MTT法，计算公式为 NK（或 M拟细胞活性％一门一（杀伤检 测孔OD值一效应细胞对照孔OD值／靶细胞对照孔OD值刀X 100％；一氧化氮浓度的测定采用 Gress试剂法。 结果：l、肿瘤重量：对照组、CY组和联合组分别为 1．15土 0．18 克、0．47士0刁6克和0．ZI士0．08克，后两组与对照组相比，均具显 著性差异中功刀5和p功刀1），且显示联合应用具有协同抗瘤作用； 2、NK和巨噬细胞杀伤活性：单用 pCmILl 质粒组的 NK 和巨噬细胞活性分别为52．05士皿18％和64．叩t7．4o，联合组的NK 和巨噬细胞活性分别为56．75幻刀6％和7o．79土7．13％，均高于对照 组的 NK细胞活性 31．5H4．75o和巨噬细胞活性 34．4be4．60o，且 均具有显著性差异巾叩05），并显示扯rnl＊12质粒和＊Y联合应 用具有协同增强两细胞杀伤功能的作用； 3、NO释放量：联合组和对照组NO释放量分别为ZI．19土l．26 和13．48ti．57（叩OI／L），单用pCmIL一12 组释放量为22．85士1．58 2 浙江大学颀士学位论文 （卜m＊几），联合组和单用pCmIL＊ 组均较对照纽有显著性差异， 但未提示联合组有协同增强巨噬细胞释放NO的作用。 结论：PCmILl 质粒联合 CY能够显著抑制转移性黑色素瘤 的生长；通过肌肉内注射 pCInIL＊ 质粒和皮内注射 CY可协同增 强NK细胞杀伤活性和巨噬细胞杀伤活性：联合应用pCml＊12质 粒和CY对巨噬细胞释放NO有否协同增强作用还不确定。