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干眼是一类受到多种因素影响的疾病,发病机制复杂,目前受到较广泛认可的是眼表一泪液分泌神经反馈环路的干眼发病学说。眼表上皮细胞作为眼表面的首道屏障,是维持眼表正常的关键结构,也是干眼发病中的主要效应组织,其改变在不同类型干眼中具有较高相似性。关于机体的应激及免疫炎症因素在干眼发病中的具体作用及其引起的眼表.泪腺功能单位的改变尚需要进一步深入研究。
本课题就上述问题进行了以下研究:
第1章:水液缺乏性千眼患者角膜上皮层内炎症细胞的分布及密度研究
目的:探讨水液缺乏性干眼患者角膜上皮层内炎症细胞的形态、分布、密度及其与泪液功能异常问的相关性。
方法:选择46例(46眼)水液缺乏性干眼患者,其中32例(32眼)为非Sjogrens综合征患者(NSS),其余14例(14眼)为Sjogrens综合征患者(SS),另外取33人(33眼)作为正常对照。应用激光共焦角膜显微镜(HRT-IIICM)观察中央部及周边部角膜上皮层内Langerhans细胞(LC)以及白细胞的分布、形态及密度,同时对这些受试者进行泪膜破裂时间(TFBUT)、泪液分泌(Schirmer I试验)、荧光素角膜染色观察,通过多因素回归分析探讨角膜上皮层内炎症细胞分布特点与干眼临床特点之间的相关性。
结果:正常对照者中央区及周边部角膜上皮层内存在一定数量LC,其密度分别为34.9±5.7 cells/mm2及90.7±8.2 cells/mm2;而水液缺乏性干眼患者角膜上皮层内的LC密度均明显增高,以中央角膜上皮层内最为显著。其中,NSS患者中央区角膜上皮层内LC数量为89.8±10.8 cells/mm2,而SS患者为127.9±23.7cells/mm2。此外,LC细胞的形态与正常对照相比较,水液缺乏性干眼患者的LC中具有多个突起以及长突起的LC比例明显增高。正常对照组角膜上皮层内白细胞数目很少,而水液缺乏性干眼患者角膜上皮内白细胞数量明显增高。统计学分析显示,角膜上皮层内LC以及白细胞这两种炎症细胞密度与干眼临床检查所示的干眼炎症程度呈明显正相关。
结论:水液缺乏性干眼患者角膜上皮层内LC以及白细胞的改变提示其可能参与干眼发病。激光共焦角膜显微镜动态观察中央角膜上皮细胞层内炎症细胞的分布、密度可以用于辅助监测干眼严重程度并帮助指导治疗。
第2章:液气界面法培养人结膜组织块建立的体外模型
目的:探讨液气界面法培养人结膜组织块所建立的体外模型的病理学特征。
方法:将球结膜组织块分别用液气界面培养法及培养基浸没法培养2周。进行HE染色,应用p63,Pax6,K16,K19和K10染色判断结膜上皮的增殖和分化情况,应用MUC5AC,MUC19,MUC4和MUC16染色判断粘蛋白的改变和杯状细胞的变化,应用TUNEL法检测结膜组织块内的凋亡细胞,应用ELISA法检测培养体系中的炎症因子MMP9,TNF-α和IL-1β浓度变化。
结果:液气界面法(AL组)培养1周以上的人球结膜组织块具有多项干眼类似的病理学特征。干燥应激后结膜上皮细胞出现明显复层化增加,而这一现象不出现在培养基浸没组(SUB组)。AL组结膜上皮的K19表达下调,表层上皮细胞出现K10阳性表达,说明其出现向角化上皮的异常分化。同时,Pax6的核内染色在液气界面培养2天开始即出现明显下降,表现为核周染色或胞浆染色。组织块体外培养4天起结膜上皮的MUC5AC表达明显减弱,10天后完全消失。AL组MUC19的成胶型粘蛋白形式的表达从培养后2天即消失,而膜结合型形式的表达也随培养时间延长逐渐减弱。两组MUC4和MUC16染色均失去了正常对照组的全层表达的形式。AL组培养2天起结膜上皮以及基质细胞出现凋亡阳性细胞,且培养10天后明显增多。AL组条件培养基内炎症介质MMP-9,TNF-α和IL-1β浓度在培养1周左右明显增高。
结论:空气暴露的干燥应激可以使体外培养的人球结膜组织出现杯状细胞减少或消失、鳞状上皮化生、细胞凋亡、粘蛋白改变、炎症介质浓度增高等改变,与临床干眼具有类似性。这一干燥应激的体外模型可以对干眼发病机制、干眼药物筛选等研究提供帮助。
第3章:液气界面法培养人结膜组织块模型中信号传导通路研究
目的:探讨空气暴露法培养人结膜组织块模型中p38MAPK信号通路以及Wnt信号传导通路的激活情况。
方法:将球结膜组织块分为4组培养2周,除液气界面法(AL)及培养基浸没法(SUB)两组外,p38MAPK通路抑制组为AL联合培养体系内加入p38MAPK抑制剂SB203580(SB组),而Wnt通路抑制组为AL联合培养体系内加入Wnt抑制剂DKK1。进行HE染色,应用磷酸化p38MAPK染色判断p38MAPK通路的激活情况,应用β-catenin及磷酸化β-catenin染色判断Wnt信号传导通路的激活情况,应用K10染色判断结膜上皮的分化方向。
结果:磷酸化p38MAPK染色显示空气暴露引起的干燥应激早期即出现结膜上皮细胞的阳性核内染色,并逐渐出现结膜基质细胞的核内染色,而SUB组染色强度明显弱于AL组,且其核染出现时间较晚。培养体系内加入SB203580后未见结膜组织内p-p38MAPK的阳性核染,也可以抑制结膜上皮细胞的异常分化,K10染色阴性。AL组培养2-6大可以检测到β-catenin及磷酸化β-catenin的表达增高,出现胞浆内聚积以及核内染色,提示Wnt信号传导通路在AL组的短期激活。培养体系内加入DKK1后,干燥应激培养的结膜组织块上皮层数减少,β-catenin染色类似于正常结膜一仅位于细胞膜表面,而K10染色阴性。
结论:液气界面法培养人球结膜组织块早期即出现p38MAPK信号传导通路以及Wnt信号传导通路的激活,阻断p38MAPK信号传导通路可以抑制上皮异常分化但不影响其增殖,阻断Wnt信号传导通路则抑制上皮细胞的增殖以及异常分化。