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目的：
研究二价金属离子转运蛋白1（divalentmetaltransport1，DMT1）在蛋白酶体抑制剂lactacystin诱导的SH-SY5Y细胞中的表达改变，从而进一步了解DMT1在PD神经元损伤中的可能作用机制。
方法：
第一部分：筛选蛋白酶体抑制剂lactacystin建立帕金森病细胞模型的作用剂量
取对数生长期的SH-SY5Y细胞，设正常对照组和2.5μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、15μmol/L、20μmol/L和25μmol/L6个lactacystin浓度组，处理后培养24h，用MTT法测定细胞吸光度观察lactacystin对SH-SY5Y细胞活力的影响，H&E染色观察lactacystin对SH-SY5Y细胞胞浆包涵体形成的影响。
第二部分：DMT1表达调控在蛋白酶体抑制剂lactacystin诱导的SH-SY5Y细胞损伤中的作用
1、Lactacystin诱导的SH-SY5Y细胞DMT1的表达情况
取对数生长期的SH-SY5Y细胞，设为正常对照组、lactacystin损伤组。正常对照组不加药，lactacystin损伤组只加lactacystin(终浓度10μmol/L)，处理后培养24h，免疫荧光方法、WesternBlotting方法检测lactacystin诱导损伤的SH-SY5Y细胞DMT1表达变化。
2、DMT1异常表达在细胞神经毒性损伤中的作用
人为模拟细胞外高Fe2+环境。根据MTT法筛选50μmol/LFe2+为最终作用浓度，避免对细胞造成过大的损伤。取对数生长期的SH-SY5Y细胞，实验分4组，分别给予药物干预后行各项指标检测。正常对照组不加药，Fe2+处理组只加Fe2+(终浓度50μmol/L)，lactacystin损伤组只加lactacystin(终浓度10μmol/L)，lac+Fe2+处理组先加入10μmol/Llactacystin处理24h，再换50μmol/LFe2+继续培养24h。
检测指标包括：
(1)荧光探针DCFH-DA检测各组细胞胞内活性氧(ROS)水平。
(2)免疫组化方法观察各组细胞胞浆包涵体形成及分布情况。
(3)WesternBlotting方法检测各组细胞α-Syn低聚体(43-55kDa)蛋白表达情况。
结果：
第一部分：蛋白酶体抑制Lactacystin诱导SH-SY5Y细胞损伤
(1)Lactacystin对SH-SY5Y细胞活力的影响
不同浓度lactacystin(2.5μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、15μmol/L、20μmol/L和25μmol/L)作用SH-SY5Y细胞24h，细胞活力随着药物浓度增加而逐渐下降，与正常对照组相比，差异均有统计学意义(P＜0.01)。
(2)Lactacystin对SH-SY5Y细胞胞浆包涵体形成的影响
H&E染色观察发现正常对照组细胞胞浆中无嗜酸性小体；5μmol/Llactacystin组个别细胞胞浆中出现圆形或者椭圆形嗜酸性小体；10μmol/Llactacystin组少量细胞胞浆中出现嗜酸性小体；20μmol/Llactacystin组大部分细胞胞浆中出现嗜酸性小体。
第二部分：DMT1表达调控在蛋白酶体抑制剂lactacystin诱导的SH-SY5Y细胞损伤中的作用
1、Lactacystin诱导的SH-SY5Y细胞DMT1表达情况
用荧光标记DMT1抗体及DAPI复染细胞核在荧光显微镜下观察发现正常对照组细胞DMT1绿色荧光弱，细胞核呈蓝色，边缘光滑完整，均匀淡染；lactacystin损伤组细胞DMT1绿色荧光强度明显增强，蓝色细胞核呈致密浓染，可见分叶、破碎状及边集现象。进一步WesternBlotting检测显示lactacystin损伤组细胞DMT1的蛋白表达量(87.68±11.11)％与正常对照组(41.64±7.77)％相比有明显增加(P＜0.01)。
2、DMT1异常表达在细胞神经毒性损伤中的作用
根据MTT法筛选Fe2+作用浓度，结果显示Fe2+对细胞的毒性作用呈浓度依赖性，浓度在100μmol/L时，细胞活性(89.78±3.78)％即与正常对照组(100.13±4.79)％存在显著性差异(P＜0.01)。为了避免对细胞造成过大的损伤，选定50μmol/LFe2+作用24h进行下一步实验。
2.1Lactacystin诱导的SH-SY5Y细胞铁孵育后胞内活性氧水平(ROS)变化
经荧光探针DCFH-DA染色在荧光显微镜下观察发现正常对照组少量细胞胞浆可见弥散低强度的绿色荧光，Fe2+处理组胞浆荧光强度较正常对照组无明显增强，lactacystin损伤组部分细胞胞核亦可见弥散的绿色荧光。与lactacystin损伤组相比，lac+Fe2+处理组几乎所有细胞失去正常突触结构，胞浆及胞核荧光强度明显增强。
2.2Lactacystin诱导的SH-SY5Y细胞铁孵育后胞浆包涵体形成与分布情况
倒置显微镜下观察正常对照组及Fe2+处理组细胞形态完整规则，胞浆整体均匀淡然；lactacystin损伤组细胞突起伸长，细胞核周围及突起末梢出现散在颗粒状α-Syn免疫阳性物质；lac+Fe2+处理组细胞突起明显缩短或消失，胞浆整体均匀深染，α-Syn免疫阳性物质由散在颗粒逐渐聚集成球状包涵体，团聚在核周边。
2.3Lactacystin诱导的SH-SY5Y细胞铁孵育后胞浆α-Syn低聚体蛋白表达的变化
WesternBlotting检测结果显示，lac+Fe2+处理组α-Syn低聚体(43-55kDa)蛋白表达量较lactacystin损伤组明显增加(P＜0.05)，分别是(96.94±14.10)％，(35.55±15.36)％，两者与正常对照组(7.99±1.71)％相比，差异均有统计学意义(P＜0.05)。
结论：
1．Lactacystin对SH-SY5Y细胞有毒性作用，可形成胞浆包涵体并诱导细胞死亡。蛋白酶体功能异常可能在PD发病中发挥重要作用。
2．Lactacystin诱导的SH-SY5Y细胞DMT1表达增加，可能是蛋白酶体功能障碍所致神经毒性作用的重要原因之一。
3．蛋白酶体功能障碍和铁代谢异常相互作用与PD发病相关。