目的:高迁移率族蛋白B1(HMGB1)作为一种晚期炎症因子和免疫调节分子，与脓毒症免疫紊乱发生密切相关，研究其免疫调节效应及机制将有助于深化对脓毒症致病机制的认识。新近发现，HMGB1对胞内信号蛋白-丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinase，MAPK)的活化具有重要调控作用，而MAPK参与了T淋巴细胞增殖、活化和分化等过程。线粒体融合蛋白2(mitofusin-2，Mfn2)是线粒体塑形蛋白的一员，除介导线粒体融合作用外，在细胞信号转导、能量代谢、增殖及凋亡等生命过程中均有重要调节作用。我们前期研究发现过表达Mfn2能够改善HMGB1诱导的CD4+T细胞免疫功能抑制状态，但其中的确切机制还不清楚。本项目通过体外实验研究MAPK在HMGB1诱导T淋巴细胞免疫功能改变中的作用，并通过基因转染技术调节Mfn2表达，探讨Mfn2在HMGB1调控T细胞免疫功能中的作用及其对MAPK活化的影响。　　 方法：体外培养人T细胞淋巴瘤细胞系Jurkat细胞，在含10％胎牛血清的RPMI1640培养基中调整细胞浓度为5×105/ml后培养于96孔培养板，首先用浓度为50ng/mlPMA和1uM的Ionomycin刺激12小时，在不同时间点加入不同剂量HMGB1。　　 实验一：应用HMGB1刺激，MTT法检测Jurkat淋巴细胞的增殖反应，ELISA法检测IL-2、IL-4、IFN-γ蛋白的表达，分析时间/剂量效应关系。　　 实验二：根据以上结果找出最佳刺激剂量，在该剂量HMGB1刺激不同时间分别用ELISA法检测ERK1/2、JNK、P38以及NFAT的活化情况；采用相应MAPK特异性拮抗剂阻断MAPK的活化，观察HMGB1诱导的T淋巴细胞功能改变及NFAT活性变化。　　 实验三：采用实验一相同时间点，应用HMGB1刺激，Western-blot和Realtime-PCR法检测Mfn2蛋白及mRNA的表达；通过基因转染技术调节Mfn2表达，然后给予HMGB1刺激，观察细胞增殖反应及IL-2蛋白表达、IFN-γ/IL-4的变化以及ERK1/2、JNK、P38以及NFAT的活化情况。　　 结果：　　 1．MAPK在HMGB1诱导T淋巴细胞免疫功能改变中的作用：(1)与正常对照组相比，100ng/ml、1000ng/ml剂量的HMGB1作用24h或48h后，T细胞增殖能力低下(P＜0.05或P＜0.01)、IL-2产生受到抑制(P＜0.01)，Th2细胞因子比例增加(IFN-γ/IL-4比值减小(P＜0.05或P＜0.01)。(2)100ng/ml剂量HMGB1刺激后，ERK1/2和P38磷酸化水平较正常对照组均显著升高，其中ERK1/2在1h活化最明显(P＜0.01)，P38磷酸化在15min时达到高峰(P＜0.01)，而JNK磷酸化无明显影响(P＞0.05)。(3)预先分别采用SuM的ERK1/2、P38特异性阻断剂U0126、SB203580孵育T细胞，然后予以100ng/mlHMGB1刺激24h，U0126和SB203580均能部分改善HMGB1诱导的T细胞免疫功能抑制状态，即与单纯HMGB1刺激组相比，HMGB1+U0126组T细胞增殖能力增强，IL-2产生增加和IFN-γ/IL-4比值上升(P＜0.05)；HMGB1+SB203580组T细胞IL-2分泌增多和IFN-γ/IL-4比值上升(P＜0.05)，但T细胞增殖无明显改变(P＞0.05)。(4)HMGB1对T淋巴细胞NFAT的活化具有抑制作用，而U0126和SB203580预处理后能明显改善HMGB1诱导的NFAT活性抑制状态(P＜0.05或P＜0.01)。(5)5uM的U0126、SB203580预处理Jurkat细胞后并未完全阻断HMGB1诱导的ERK1/2、P38磷酸化，与P/I组相比，ERK1/2和P38仍存在一定程度活化(P＜0.05或P＜0.01)。　　 2．Mfn2在HMGB1介导T淋巴细胞免疫功能改变中的作用及其对MAPK活化的影响：(1)与正常组相比，PMA/Ionomycin刺激后Mfn2mRNA及蛋白的表达有所增强；与P/I组比较，10ng/mlHMGB1刺激24h后Mfn2mRNA表达改变并不明显，而100ng/ml、1000ng/mlHMGB1刺激后明显下降(P＜0.05或P＜0.01)；100ng/mlHMGB1刺激24h或48h，Mfn2的表达量显著下降(P＜0.05或P＜0.01)。(2)与P/I组比较，在未给予HMGB1刺激的情况下，过表达Mfn2导致细胞增殖能力明显下降(P＜0.01)、IL-2产生下降(P＜0.05)，而IFN-γ/IL-4比值无明显改变；但过表达Mfn2能明显减轻HMGB1诱导的T细胞免疫功能抑制状态，即与HMGB1刺激组比较，HMGB1+Lv-Mfn2组细胞增殖反应增强(P＜0.05)、IL-2分泌增加(P＜0.05)，IFN-γ/IL-4比值升高(P＜0.05)。(3)与HMGB1组相比，过表达Mfn2并没有明显改变HMGB1诱导的ERK1/2、P38的磷酸化水平(P＞0.05)。(4)在未给予HMGB1刺激的情况下，过表达Mfn2导致细胞NFAT活性下降(P＜0.01)；但与HMGB1组相比，过表达Mfn2能够部分减轻HMGB1对NFAT活性抑制作用(P＜0.05)。　　 结论：　　 1．HMGB1对T细胞增殖和细胞因子分泌等免疫功能均有直接调节效应；HMGB1能以时间/剂量依赖性抑制T淋巴细胞增殖反应、IL-2分泌和出现Th2相关免疫反应，且这一过程至少部分是与ERK1/2、P38的过度磷酸化及其下游转录因子NFAT活化受抑相关，提示MAPK的过度活化可能是脓毒症免疫功能紊乱发生的一个重要原因。　　 2．HMGB1能够时间/剂量依赖性抑制Mfn2的表达，人为维持Mfn2表达能减轻HMGB1对T细胞免疫功能的抑制作用，而且这一作用并不通过Ras-ERK1/2/MAPK信号通路来实现的，可能和其它与NFAT相关信号途径有关。