【摘 要】
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产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens,C.perfringens）感染导致的肉鸡坏死性肠炎（necroticenteritis,NE）多发于肉鸡饲养后期（尤其在休药期阶段）,受限于抗生素疗效日益降低及药物残留的限制,每年给肉鸡养殖业造成经济损失巨大。伴随着抗菌药物日益严峻的耐药性问题,世界各国相继出台了禁用或限制抗生素作为饲料促生长剂的政策法规。为了消除休药期内肉鸡养殖频繁
【基金项目】
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国家自然科学基金面上项目（31772782）；
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产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens,C.perfringens）感染导致的肉鸡坏死性肠炎（necroticenteritis,NE）多发于肉鸡饲养后期（尤其在休药期阶段）,受限于抗生素疗效日益降低及药物残留的限制,每年给肉鸡养殖业造成经济损失巨大。伴随着抗菌药物日益严峻的耐药性问题,世界各国相继出台了禁用或限制抗生素作为饲料促生长剂的政策法规。为了消除休药期内肉鸡养殖频繁面临产气荚膜梭菌感染的持续困扰,迫切寻求能够控制肉鸡产气荚膜梭菌感染的抗生素替代策略或药物。产气荚膜梭菌在感染过程中主要依赖于Ⅳ型菌毛系统（TFP）介导表型功能,如滑动运动和生物被膜促进菌体黏附和定植在宿主肠道上皮细胞,进一步获取营养,在肠道中大量复制和增殖,最终发挥致病作用。中药来源的天然化合物,具有来源广泛、活性多样、价格低廉和无药物残留等诸多优点,成为新药研发的重要资源宝库。在前期基础之上,通过靶向产气荚膜梭菌TFP开展抑制剂筛选,获得了活性良好的穗花衫双黄酮。本研究选择侧柏叶作为原药材,通过正交优化试验确定最佳醇提提工艺,即按侧柏叶药材10倍量加入70%乙醇,回流提取2次,每次1h,合并滤液,减压回收,60℃浓缩至相对密度为1.12～1.14,喷雾干燥;通过正交优化试验确定了侧柏叶颗粒剂的处方,即5000g侧柏叶药材经提取浓缩和喷雾干燥后,分别加入40g羧甲基淀粉钠和100g黄原胶,最后加入水溶性淀粉补全至1000g;确定了侧柏叶颗粒剂的制剂工艺路线,取侧柏叶药材5000g粉碎,10倍量70%乙醇,冷凝回流提取2次,1h/次,合并滤液,减压回收浓缩至相对密度为1.12～1.14,经进风温度230℃,出风温度90℃,进料流量为40 m L/min,雾化器转速为25000r/min条件下喷雾干燥,过80目筛,然后加入40g羧甲基淀粉钠,100g黄原胶,水溶性淀粉加至1000g,混匀即得;对侧柏叶颗粒剂高效液相色谱含量测定方法进行了系统性方法学考察,此法的灵敏度高,专属性强,重现性好,穗花衫双黄酮的浓度在0.01～0.8 mg/m L范围内,线性关系良好;通过稳定性考察,确定侧柏叶颗粒剂宜在常温、避光和干燥处保存,有效期暂定为12个月;通过滑动运动、生物被膜形成、细胞毒性检测、细胞黏附试验、q RT-PCR和透射电子显微镜检测,发现侧柏叶颗粒显著抑制产气荚膜梭菌TFP相关基因m RNA的转录,破坏菌体表面菌毛的形态结构,抑制TFP结构形成,进而抑制产气荚膜梭菌TFP的功能;通过侧柏叶颗粒对肉鸡人工感染梭菌性肠炎预防作用研究,发现侧柏叶颗粒显著缓解感染肉鸡的临床症状、粪便状态和肠道病理损伤,提高了感染肉鸡的生长性能,按照临床推荐剂量（500倍稀释）预防梭菌性肠炎效果最佳。综上所述,本研究从侧柏叶提取工艺、处方工艺、制备工艺、含量测定方法确证、稳定性考察、体外药效学评价、作用机制和肉鸡人工感染梭菌性肠炎预防作用研究等方面,对侧柏叶颗粒剂进行了全方位和系统性研究,制备出含量稳定、药效确实和作用机制明确的新型中兽药颗粒制剂。结果表明,侧柏叶颗粒剂体外药物活性良好、含量较高和稳定性强,对肉鸡人工感染梭菌性肠炎具有理想的预防作用,阐明了侧柏叶颗粒剂通过抑制TFP相关基因m RNA转录,破坏菌体表面菌毛形态结构,抑制TFP结构的形成的作用机制,为抗产气荚膜梭菌感染防控提供了新型药物研发策略和候选中兽药制剂。
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