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目的:p55PIK是PI3K的一个调节亚基,在调节细胞周期以及炎症进程中都发挥着重要作用,并且p55PIK在肝癌临床肿瘤样品中大量表达,前期实验发现向肝癌细胞中添加p55PIK特异性抑制剂P15多肽,可以起到抑制肝癌细胞生长,以及下调肝癌诊断指标AFPmRNA表达水平的效应,所以本课题的研究目的是阐明p55PIK调控AFP表达的分子机制。方法:以肝癌细胞系HepG2为研究对象,超表达和沉默p55PIK,然后利用实时定量PCR以及westernblot的方法检测细胞中AFP的mRNA含量以及蛋白含量,明确肝癌细胞中p55PIK对AFP的调节效果;用p55PIK特异性抑制剂P15处理肝癌细胞,检测NF-κB的活性,证实在肝癌细胞中p55PIK可以调节NF-κB的活性;以肝癌细胞系HepG2为研究对象,分别加入NF-κB特异性抑制剂PDTC以及p55PIK特异性抑制剂P15后,利用实时定量PCR以及westernblot的方法检测细胞中AFP的mRNA含量以及蛋白含量,证实肝癌细胞中NF-κB对AFP的调节效果;通过同时上调p55PIK以及抑制NF-κB的方法,观察抑制NF-κB是否可以抵消上调p55PIK导致的AFP上调,证实P55PIK通过NF-kB信号路径解调节AFP表达;利用荧光素酶报告系统,确定AFP基因启动子上受NF-κB调控的片段;利用生物信息学的手段,分析并预测AFP基因启动子上受NF-κB调控的片段中可能与NF-κB结合的位点;利用点突变技术,观察上述DNA位点对p55PIK/NF-κB对AFP转录活性的影响,明确哪些位点在p55PIK/NF-κB调控AFP转录活性中发挥重要作用。结果:观察到AFP的mRNA水平与加入的P15量呈浓度依赖性,随着加入的P15量增加AFP的mRNA表达量逐渐减少,并且沉默p55PIK后AFP的蛋白表达量显著降低,超表达p55PIK后AFP的表达量显著增加;向HepG2细胞中加入NF-κB抑制剂(PDTC)后,会起到下调AFP的mRNA及蛋白表达水平的效应;分别向HepG2细胞中加入P15和PDTC后,检测NF-κB通路关键蛋白的表达情况,加入P15后p65表达量没有显著变化,p65(ser536)磷酸化水平显著降低,IKBα表达量显著升高,IKBα(ser36)磷酸化水平显著降低,加入PDTC后p65表达量显著降低,p65(ser536)磷酸化水平显著降低,IKBα表达量显著升高,IKBα(ser36)磷酸化水平显著降低,观察(control,p55PIK,p55PIK+PDTC)实验组,PDTC可以抵消由于过表达p55PIK而引起的AFP表达量升高;构建得到AFP基因上游调控区不同片段的荧光素酶报告基因载体(-5229/-16)-AFP,(-3375/-16)-AFP,(-1865/-16)-AFP和(-225/-16)-AFP,酶切以及测序鉴定分子量序列正确,检测分别加入P15和PDTC对不同长度的AFP启动子转录活性的影响,结果显示(-5184/+29)-AFP和(-3330/+29)-AFP变化最为显著,即NF-κB的调控位点主要在(-5184,-1820)片段上;对报告基因活性变化最大的片段(-5184,-1820)进行预测,位点(-4717/-4726),(-4372/4381),(-3171/3180)可能是NF-κB与AFP启动子结合并调控该片段的转录活性的位点;以全长AFP基因启动子报告基因载体(-5229/-16)-AFP为模板,对上述位点进行点突变,并比较添加P15和PDTC前后报告基因载体突变对AFP基因转录活性的影响程度,结果显示(-4717/-4726),(-4372/4381)突变后P15和PDTC不再能够调节AFP的转录活性,即位点(-4717/-4726),(-4372/4381)是在p55PIK/NF-κB调控AFP转录活性的关键位点。结论:在肝癌细胞中,p55PIK介导的信号通路参与了肝癌生物标志蛋白AFP的表达;实验结果还表明p55PIK对AFP表达的调控是通过NF-κB信号通路实现的;在AFP启动子上游的NF-κB的作用位点(-4717/-4726),(-4372/4381)在p55PIK/NF-κB调节AFP转录活性中发挥重要作用。