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甘蓝(BrassicaoleraceaL.),属于十字花科(Brassicaceae)芸薹属(Brassica)甘蓝种,是芸薹属的一年生或两年生草本植物,也是我国主要的蔬菜作物之一,全国各地均有种植。芸薹根肿菌(PlasmodiophorabrassicaeWoronin)是十字花科根肿病的病原菌,根肿病是一种世界性土传病害,任何十字花科植物的感病品种都可被这一病菌侵染。近年来,我国甘蓝根肿病发病面积迅速增加,致使甘蓝品质和产量都大幅度下降,选育抗病品种是防治根肿病的有效途径之一。抗性鉴定是抗病育种的基础,但容易受到环境的影响,且周期较长。DNA分子标记有利于为甘蓝提供准确、可靠的遗传标记,利用与抗病基因紧密连锁的分子标记进行辅助选择可以加速抗病育种的进程。 近年来发展起来的RAPD技术,具有操作简单方便的优点。但其反应容易受条件的影响,重复性和稳定性较差,在RAPD技术的基础上开发出来的SCAR标记,与其他分子标记相比,其操作简单,成本低,重复性好。SCAR标记的开发利用提高了分子标记辅助选择育种的效率,同时有利于大量样品的快速分析。本研究首先以感病品种京丰一号为材料,对甘蓝无性系根肿病抗性鉴定体系进行了研究;其次以引进的先正达公司抗病品种“GZ87”为材料,以公布的RAPD标记为基础,进行了SCAR标记的开发;第三以抗根肿病F1代甘蓝品种“GZ87”和感病甘蓝自交系“263”为亲本构建含有110个株系的CP群体,然后通过与感病自交系“263”回交构建了BC1群体。对BC1群体进行人工接种鉴定,结合SCAR分子标记辅助选择,确定其抗感情况,构建DNA-BSA池,进行了关联分析研究。主要研究结果如下: (1)利用感病品种“新京丰一号”通过水培接种和土培接种的方法建立了甘蓝无性系根肿病抗性鉴定体系。将甘蓝品种“新京丰一号”通过组织培养的方式获得无性系植株,将无性系植株分别移栽到水培和土培中。水培接种鉴定:移栽7d后在营养液中进行人工接种,使营养液中休眠孢子浓度为2×108CFU/mL。定期更换营养液。土培接种鉴定:无性系植株缓苗后移栽到按照草炭、蛭石、珍珠岩的比例为2∶1∶1(体积比)配制的基质中,营养钵和基质经过两次高温灭菌,采用灌根法人工接种,将孢子悬浮液浓度调至2×107CFU/mL,然后每株浇灌20mL根肿菌休眠孢子悬浮液接种根肿菌。接菌前一天和接菌后一个星期托盘里保持水深1cm左右。定期浇灌营养液。 两种接种方法的培养条件为:昼夜温度26/20℃(白天/黑夜),光照强度5000lx,光周期为14h。定期浇灌Hoagland营养液和蒸馏水。接种6周后洗净甘蓝的根系,于无菌水中再清洗1次,然后调查植株发病情况。 在水培条件下,根肿病在植株的根部无病根表型,但是土培接种后,植株的发病明显,土培接种方法更适于甘蓝无性系根肿病抗性鉴定。 (2)基于先正达公司已公布的2个甘蓝根肿病抗性的RAPD标记,以“GZ87”为试验材料,通过PCR扩增、特异片段回收、克隆以及测序,根据测序结果设计新的引物,成功设计了SCAR标记。以先正达公司的其他抗病甘蓝品种作为材料,通过PCR扩增、测序以及与RAPD标记序列比对,来确定了SCAR标记的准确性。 (3)用SCAR标记对110个CP群体基因型进行PCR扩增,其中有58个株系扩增出特异性条带。将CP群体与轮回亲本“263”回交得到的76个株系BC1群体,然后进行BC1群体人工接种鉴定,确定其抗感情况,选择极抗和极感各17个株系提取DNA后,构建DNA-BSA混合池。通过重测序,得到高质量的可信SNP位点和InDel位点分别为1338555、338999个。利用ED法和SNP-index法分别进行结果关联,得到的交集关联区域是C7:39590000-44050000,距离为4.46Mb,共有737个基因;利用ED法和InDel-index法分别进行结果关联,得到的2个交集关联区域是C7:39400000-43840000和C7:43880000-43880000,距离分别为4.46Mb、0Mb,分别有737个、1个基因。通过BLAST软件对将候选区间内的编码基因进行多个数据库的深度注释。在候选区域内快速筛选并注释到700个基因,其中在亲本间存在非同义突变基因共注释到542个,移码突变基因共注释到233个。