膀胱癌是泌尿系统常见的恶性肿瘤的。它在中国有很高的发病率。传统的治疗方法包括手术、放疗和化疗,化疗的价值有一定的局限性,这是因为化疗会伤害正常细胞并导致复发率增高。近年来,随着分子生物学取得了突飞猛进的进展,基因治疗现如今已成为一种治疗膀胱癌的新的策略。血管紧张素Ⅱ (Angiotensin Ⅱ, AngⅡ)是肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensin system, RAS)中的一种生物活性肽,它通过与某些特定器官的AT1受体(AT1R)和AT2受体(AT2R)结合,调控心血管系统的稳态和组织的生长。AT2R在胚胎组织中高度表达,而在人体出生后其表达急剧降低。当心血管系统或者神经系统发生损伤时,AT2R会在修复组织损伤的过程中重新表达。有研究发现AT2R具有抑制细胞周期的功能,它可能在癌症中能够发挥抑制肿瘤生长的作用。提高AT2R在多种癌细胞系,例如前列腺癌、肺癌、嗜铬细胞瘤和结直肠癌等细胞系中的水平,能够诱导细胞凋亡,而且癌细胞的生长会受到抑制。在我们的实验研究中,用表达AT2R的重组腺病毒载体将AT2R导入膀胱癌细胞中,以此来提高AT2R的表达水平,通过Q-PCR,流式细胞分选,凋亡染色等实验技术,检验AT2R的过度表达对膀胱癌细胞周期和凋亡的作用,并进一步探讨其可能的细胞内作用机制。方法与材料1.细胞培养1.1、复苏把冻存管从液氮中取出来,立即投入37℃水浴锅中,轻微摇动。液体都融化后,拿出来喷洒酒精后放到超净工作台里。把上述细胞悬液吸到装10ml培养基的15ml的离心管中1000转离心5分钟。把上清液倒掉,加1ml培养基把细胞悬浮起来。吸到装有10ml培养基的10cm培养皿中前后左右轻轻摇动,使培养皿中的细胞均匀分布。1.2传代培养皿中的细胞覆盖率达到80%-90%时要传代。把原有培养基吸掉,加适当的胰蛋白酶,消化1-2分钟,细胞都变圆后加如入等体积的含血清的培养基终止消化,用移液枪吹打细胞,把细胞都悬浮起来。把细胞吸到15ml的离心管中,1000转离心5分钟。倒掉上清液,加1-2ml培养基,把细胞都吹起来。移入培养瓶继续培养。2.重组腺病毒制备我们采用以下两种重组腺病毒载体,一种是腺病毒载体包含被巨细胞病毒启动子控制的增强绿色荧光蛋白基因(Ad-CMV-EGFP),而另一种腺病毒载体包含AT2R基因和被巨细胞病毒启动子控制的增强绿色荧光蛋白基因(Ad-G-AT2R-EGFP)。293T细胞接种于150mm2的组织培养皿中。感染复数(multiplicity of infection, MOI,virus/cell)为10的重组腺病毒载体被转到入293T细胞中。36至48小时后可观察细胞病变。通过冻融和两个氯化铯密度梯度的超速离心进行提纯,根据腺病毒DNA的OD260nm和OD280nm计算病毒颗粒和纯度,并通过空斑实验检测病毒滴度。3.测量提取RNA的浓度用含AT2R的腺病毒感染EJ细胞,48小时后,收集细胞,依据TRIZOL试剂盒说明书,提取RNA。之后,利用紫外分光光度计测定RNA的浓度及RNA在260nm和280nm的OD值。4.检测AT2R的表达我们从两个方面去观察,(1),腺病毒感染膀胱癌(EJ)细胞后,分别在24h、48h、72h通过荧光显微镜观察膀胱癌细胞,是否有绿色荧光蛋白的高效表达。(2),运用QPCR的技术,在腺病毒(含有Ad-G-AT2R-EGFP),对照组腺病毒(Ad-CMV-EGFP),感染膀胱癌细胞48小时后。按照TRIZOL使用说明书,提取膀胱癌细胞RNA,进行逆转录,转录成CDNA, AT2R引物为5’-CCACCCTTGCCACTACTAGCA-3’;5’-CATTGTTGCCAGAGAT GTTCACA-3’.然后使用荧光定量PCR技术,其目的是为了检测细胞内AT2的表达水平。5.AT2R基因对EJ细胞形态的影响膀胱癌细胞(EJ细胞系,106/ml每孔)被接种于150mm2的组织培养皿中。第二天,Ad-CMV-EGFP或Ad-G-AT2R-EGFP被转导入膀胱癌细胞中。细胞培养液为添加10%FBS的DMEM。24小时、48小时和72小时后观察细胞形态。培养48小时后的细胞被用于凋亡试验。6.AT2R基因对EJ细胞周期的影响。膀胱癌细胞经过腺病毒感染后48小时,胰酶消化,悬浮细胞,经过PBS洗涤和离心后,用冰冻的70%乙醇固定至少18小时。然后放置于保持室温的暗室中,细胞在300μL的0.1%PI(50mg/L propridium iodide,0.1%sodium-citrate,0.1%tritonX-100)中再次悬浮30分钟。运用流式细胞术和ModFit LT software (Verity)进行细胞周期分析。7.AT2R基因对EJ凋亡的影响为检测凋亡的细胞,在病毒转导细胞48小时后,我们依据试剂盒的说明书进行TUNEL凋亡染色试验。细胞核中如果具有棕色颗粒的细胞为TUNEL阳性细胞。如果细胞核中未有棕色颗粒的细胞为TUNEL阴性细胞,即未发生凋亡细胞。8.蛋白印迹试验收集细胞样本进行蛋白印迹试验(Western blot)。使用RIPA裂解液裂解细胞并且离心以获得含有蛋白质的上清液。测量蛋白质浓度,然后依据蛋白印迹试验说明书知道,经行蛋白印迹试验,其中一抗包括抗p38MAPK抗体、抗磷酸化P38(PP38)、抗P53抗体、抗磷酸化P53(pp53)抗体和抗激活的caspase3抗体。这些抗体从Cell Signaling Technology购得。抗p肌动蛋白抗体和二抗从Sigma-Aldrich购得。9. siRNA干扰P38、P53我们运用RNA干扰技术,干扰膀胱癌细胞(EJ细胞)P38、P53的合成,取对数期生长良好的膀胱癌细胞(EJ),传代培养后24小时,运用脂质体转染技术,将P38、P53干扰RNA转导入细胞内,沉默P38、P53基因,24小时后,加入腺病毒Ad-CMV-EGFP、Ad-G-AT2-EGFP.观察沉默P38、P53是否会对AT2R过表达导致膀胱癌细胞凋亡是否会产生影响,以明确AT2R过表达导致膀胱癌细胞凋亡是否是通过P38、P53路径导致。10.数据分析数据是用三个独立实验数据的mean±SE表示。通过单因素或双因素方差分析并根据邦弗朗尼(Bonferroni)事后检验法来比较每个平均值,从而来分析数据的显著性。由于P<0.05,说明数据具有显著差异。结果1.重组腺病毒载体构建和转导两种重组腺病毒载体(Ad-CMV-EGFP, Ad-G-AT2R-EGFP)通过两个氯化铯密度梯度超速离心进行提纯,检测其OD260,计算其密度分别为1x109和1.2x109,并且纯度良好(OD260/OD280>1.3).荧光显微镜图显示EJ细胞转入了Ad-G-AT2R-EGFP (10ifu/cell), Ad-CMV-EGFP(10ifu/cell)48小时后,荧光活性均高,而转入了Ad-G-AT2R-EGFP (100ifu/cell)则显示出明显抑制细胞的生长,这样可能存在病毒对EJ细胞产生细胞毒性,对照组Ad-CMV-EGFP(10ifu/cell)细胞生长状态良好,并无细胞数量减少或者凋亡的现象发生,这表明,10MOI值的腺病毒对膀胱细胞癌(EJ)的生长并无太大影响。通过实验表明,10ifu/cell为腺病毒感染EJ细胞最适合浓度。EJ细胞对腺病毒具有高度敏感性,并且随着病毒量的不断加大,其转染率也不断提高。当病毒量为10MOI时,转染率达就可达到90%以上。但当病毒量继续升高达到100MOI时,细胞生长会受到一定程度的病毒抑制。据此我们确定10MOI为以下实验的最佳感染剂量(既可达到较高感染率,又不会对细胞生长造成明显影响)。2.测量提取RNA的浓度细胞培养48h后,通过TRizol提取RNA,利用紫外分光光度计测定RNA的浓度及RNA在260nm和280nm的OD值。测得Ad-CMV-EGFP为0.75ug/ul OD260/0D280=1.95, Ad-G-AT2-EGFP为0.8ug/ul OD260/0D280=1.92。说明所提取的RNA纯度较好,为进一步的QPCR检测实验奠定基础。3.AT2在腺病毒转导膀胱癌细胞后的表达荧光定量PCR结果显示：在转导腺病毒Ad-G-AT2R-EGFP的实验组膀胱癌细胞内的AT2的含量明显高于转导腺病毒Ad-CMV-EGFP的对照组膀胱癌细胞。这表示,我们的载体是构建成功,并且成功制备了含有AT2基因的腺病毒。4.在EJ细胞中AT2R高表达对细胞生长和细胞周期的作用通过细胞周期分析显示,与转导Ad-CMV-EGFP (10ifu/cell,24hours)的EJ细胞即对照组细胞相比,转导了Ad-G-AT2R-EGFP (10ifu/cell,24hours)的膀胱癌细胞中,处于G1期的细胞明显增加,处于S期的细胞增加不明显。处于G2期的细胞数量明显减少。5.膀胱癌细胞中AT2R过度表达能诱导细胞凋亡膀胱癌细胞转导入Ad-G-AT2R-EGFP两天后,与转导Ad-CMV-EGFP的对照组细胞相比,出现了大量凋亡的细胞。运用TUNEL法可以检测到转导Ad-G-AT2R-EGFP的细胞中存在凋亡的细胞,即那些细胞核中含有棕色颗粒的细胞。可以在转导Ad-G-AT2R-EGFP的细胞中观察到细胞毒性,这些细胞中有大量细胞死亡(n=3次试验),而转导Ad-CMV-EGFP的细胞中出现极少数死亡细胞(n=3次试验)。6.AT2R诱导细胞凋亡是否通过p38MAPK和Caspase-3信号通路?蛋白印迹试验的结果显示膀胱癌细胞43kDa的蛋白质与抗磷酸化p38MAPK (pp38)反应。与转导Ad-CMV-EGFP的细胞相比,转导Ad-G-AT2R-EGFP的细胞的p38MAPK, pp38MAPK水平并无明显变化。与对照组细胞相比较,转导Ad-G-AT2R-EGFP的细胞的pp53等活性均轻微增高。转导AD-G-AT2-EGFP的细胞的P53与转导Ad-CMV-EGFP相比较而言变化不大,没有显著差异。与对照组相比较,转导Ad-G-AT2-EGFP的膀胱癌细胞中,caspase-3条带明显多于对照组Ad-CMV-EGFP的条带。7.siRNA干扰P38、P53干扰膀胱癌细胞(EJ细胞)P38、P53的合成后,我们发现,对AT2R过表达产生膀胱癌细胞凋亡,并无明显改变,细胞生长依旧受到抑制,细胞凋亡依旧存在。经过双盲法在计算机下计算凋亡细胞数目发现,与未被沉默掉P38、P53的癌细胞相比,凋亡细胞数目基本相似。结论与讨论：膀胱癌是泌尿系统恶性肿瘤的一种。与传统治疗方法相比,基因治疗现在已经成为一种新的方法。肾素-血管紧张素系统在调控癌细胞生长和细胞周期方面发挥着重要的作用。血管紧张素Ⅱ的2型受体(Ang II type2receptors,AT2R)在前列腺癌、肺癌、嗜铬细胞瘤和结直肠癌细胞等癌细胞中具有抑制生长和抑制细胞周期的功能。为了进一步研究AT2R在膀胱癌细胞中所起的作用,我们在实验室构建了表达AT2R的重组腺病毒载体,这些载体通过腺病毒被导入膀胱癌细胞株(EJ细胞株),这样可以导致AT2R在细胞中的过度表达。通进一步分析表明在转导后的膀胱癌细胞株中,AT2R水平是有所提高的,在细胞周期的分析中,诱导细胞周期的停滞,尤其是S期的细胞明显减少,而G1的细胞有所增多；另外,AT2R的过度表达还诱导了EJ细胞的凋亡。根据蛋白印迹试验和反转录PCR试验的结果发现AT2R诱导细胞凋亡的功能与p38丝裂原激活蛋白激酶,caspase-3和p53的激活并无相关。AT2R诱导膀胱肿瘤细胞凋亡可能的机制,还需要更进一步研究。本实验存在以下优点,第一,首次报道了AT2R过表达导致膀胱癌细胞凋亡。这为膀胱癌的基因治疗,提供了一种新的思路。第二,本实验在病毒量10MOI值时,就对膀胱癌细胞产生明显的凋亡作用,这对未来研究AT2R过表达导致膀胱癌细胞凋亡提供了毒性小,感染能力高,病毒含量低等优良的载体。第三,我们实验成功的把AT2R与膀胱癌相结合。并发现其凋亡通路并非通过传统的P38,P53路径导致,这对AT2R的凋亡细胞路径可能提供有一新的通路。这一切都揭示了AT2R可能成为膀胱肿瘤细胞的又一凋亡诱导因子,并且,综上结果表明AT2R有可能成为膀胱肿瘤基因治疗的一个有效靶点。我们实验室也将继续深入的研究AT2R对膀胱癌的影响,为未来膀胱癌的基因治疗奠定实验基础。