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作为新型分子成像技术,质谱成像无需特异性标记和复杂样品前处理,可对生物组织切片中内源性或外源性等多种分子进行同时成像检测,获得分子定性定量和定位信息,具有高分辨率,高灵敏度,高特异性,质量范围宽,实验周期短等特点,近年来该技术应用于生命科学领域在药物及其代谢产物组织的分布、疾病诊断标志物的发现、疾病发展进程机制探索等应用引起了高度关注。目前,代谢组学通过定性定量分析研究生物体受外在刺激或者扰动后整体代谢物的变化及变化规律已成为代谢生物标志物筛选及内源性分子调控代谢机制探索的强大工具。基于质谱成像技术衍生的空间分辨代谢组学通过表征代谢物分子的原位空间信息尤其适合可视化器官或组织在不同组织微区的代谢轮廓改变,在药物损伤的发生、发展、消失进程中生物标志物的筛选具有独特优势,可更深层次和准确了解代谢物在疾病发生发展过程中的作用与机制。基于药物所质谱课题组前期自主研发的空气动力辅助解吸电喷雾电离质谱成像技术（Air-flow-assisted desorption electrospray ionization mass spectrometry imaging,AFADESI-MSI）技术,本课题通过合作引入该技术到药物毒理学领域,开展了以下研究内容突出该技术应用至毒理学研究中的独特优势及广阔前景,其主要内容包括以下2个部分:1.基于质谱成像技术探究5-羟甲基糠醛的肾毒性作用机制5-羟甲基糠醛（5-Hydroxymethylfurfural,5-HMF）是美拉德反应（Maillard reaction,MR）的副产物。葡萄糖注射液高温灭菌过程中可产生5-HMF,该化合物被报道具有肾毒性,课题组前期考察了 5-HMF静脉给药ICR小鼠的急性毒性,半数致死剂量（medianlethaldose,LD 50）为871.12mg/kg,14天后病理学检查结果显示存活小鼠肾脏呈现慢性进行性肾病改变,其肾脏相关的毒性机制及潜在早期毒性预测指标有待进一步研究。基于AFADESI-MSI分析5-HMF在不同时间点对小鼠肾脏微区的内源性代谢物点的改变情况,筛选5-HMF肾毒性早期相关的生物标志,探究可能具有的肾毒性机制。ICR小鼠以300 mg/kg剂量静脉给药5-HMF,对照组给予生理盐水,于1 h、4 h、24 h时间点分别取肾组织,通过AFADESI-MSI质谱成像技术可视化肾脏组织微区的空间轮廓,检测到代谢物在组织微区中的特异性分布,进一步分别从肾髓质和肾皮质中提取质谱数据进行峰对齐和归一化,采用多变量统计分析筛选出各时间点下肾髓质和肾盂中差异代谢物,进行初步鉴定后发现检测到的代谢物包括脂肪酸类、磷脂类、氨基酸类、有机酸类、核苷类、嘌呤类,其中代表性代谢物有苯丙氨酸,腺苷,腺嘌呤,次黄嘌呤,鸟苷单磷酸,FA-22:6等,进一步将差异代谢物富集分析发现5-HMF给药后发生显著变化的代谢通路主要涉及:嘌呤代谢,丙氨酸天冬氨酸和谷氨酸代谢,精氨酸合成,三羧酸循环和嘧啶代谢5个通路。将综合各类代谢物在不同时间点的变化趋势,筛选出次黄嘌呤,FA-22:6,LPG-22:6可能作为5-HMF早期肾毒性的预测指标,推荐5-HMF给药后4h是检测药物毒性标志物的最佳时间。基于质谱成像技术可视化5-HMF引起的肾脏结构微区的代谢变化,揭示了 5-HMF可能的肾毒性机制,为5-HMF肾毒性靶点研究提供前期理论基础,也为药物肾脏毒理学机制研究提供了新的技术支持。2.整合网络毒理学和质谱成像技术研究何首乌D组分的肝毒性机制何首乌作为传统中药,生何首乌具有解毒、除疟、润肠、助便等功效,制何首乌可调理肝肾、补益精血、乌黑须发、强健筋骨,但是由何首乌引发肝毒性的不良反应频频报道,而目前毒性机制尚不完全明确,本实验室前期采用斑马鱼胚胎模型对何首乌提取成分进行毒性评价,发现70%乙醇提取物中95%EtOH洗脱的D组分（何首乌D组分,PM-D）肝毒性最强,进一步鉴定PM-D出的25种主要成分并基于斑马鱼胚胎模型评价各成分的肝毒性,结果显示8种化合物具有明细的肝毒性。本研究拟采用网络毒理学和空间分辨代谢组学阐明何首乌D组分的肝毒性机制。本研究首先对PM-D进行了急性毒性实验（剂量分别为500,1000,2000,5000 mg/kg）,结果显示所有剂量的小鼠均未出现死亡和异常毒性症状,大体解剖未见明显病理改变。然而,前期PM-D在斑马鱼模型急性毒性实验中显示出非常明显的肝毒性。考虑物种差异性,进一步重复给药PM-D 2 g/kg连续7天后,通过病理和生化检查评估其对小鼠肝脏的损伤作用。生化指标显示给药组肝功能相关指标出现明显上调,病理结果表现给药组肝细胞肥大,肝窦扩张,微肉芽肿,轻度变性坏死。针对8种关键毒性化合物,包括大黄素（Emodin）,大黄酸（Chrysophanol）,大黄素-6-β-D-葡萄糖苷（Emodin-6-O-β-D-glucopyranoside）,大黄素-8-β-D-葡萄糖苷（Emodin-8-0-β-D-glucopyranoside）,1,3,8-Trihydroxy-6-methyl-10H-anthracen-9-one,顺式-大黄素-大黄素二蒽酮（Cis-emodin-emodin dianthrones）,反式-大黄素-大黄素二蒽酮（Trans-emodin-emodin dianthrones）,Polygonumnolide C4,进行网络毒理学分析发现PM-D的30个潜在肝毒性靶点。GO和KEGG富集分析显示,共同靶点涉及多种生物活性和信号通路,包括有机氮化合物代谢过程、细胞对内源性刺激的反应、激酶活性的正向调节、凋亡过程的调控、活性氧代谢过程的正调控、PI3K-Akt信号通路、AMPK信号通路、mTOR信号通路、HIF-1信号通路、Ras信号通路及MAPK信号通路等。分子对接结果证实,8种关键毒性成分与10个核心靶点（mTOR、PIK3CA、AKTl、EGFR等）具有较高的结合活性。质谱成像检测PM-D代谢物在小鼠肝脏中高度富集。空间分辨代谢组学结果表明PM-D给药后代谢谱发生了显著变化,代谢产物如牛磺酸、牛磺胆酸、腺苷、酰基肉碱等与PM-D诱导的肝损伤有关。代谢通路富集分析显示,亚麻酸和亚油酸代谢、肉碱合成、支链脂肪酸氧化等6种代谢途径发生显著变化。综合分析揭示PM-D引起的肝毒性与胆汁淤积、线粒体损伤、氧化应激导致能量代谢、脂质代谢紊乱等密切相关。本研究通过网络毒理学和空间分辨代谢组学相结合的方法,全面阐述了 PM-D多靶点肝毒性作用机制,为进一步研究PM的毒性机制和临床安全使用提供了基础理论。综上所述,质谱成像技术将整体动物或各器官为研究对象,可快速确定药物毒性作用靶器官,进一步开展相关毒性标志物及毒性代谢机制的研究可对药物尤其中草药复杂组分毒性进行科学的、综合的阐释,为药物毒性预测,安全性评价以及现代中药的药理毒理评价体系提供新的技术支持,由于代谢物生物学过程的复杂性,仍需分子生物学实验进一步确证。