【摘 要】
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乳腺癌是世界上女性发病率和死亡率最高的恶性肿瘤,在中国也是女性最常见的肿瘤。乳腺癌的远端器官转移对预后有显著影响,是乳腺癌患者死亡的主要原因。乳腺癌常见的转移器官包括骨、肺、肝、脑等。不同的肿瘤细胞优先定植转移到特定的靶器官,其成功转移取决于靶器官特异性微环境与肿瘤细胞的相互作用,但具体转移机制尚未明确。乳腺癌转移模型是筛选乳腺癌转移相关基因、研究转移嗜器官性和探究肿瘤转移分子机制的重要研究工具,
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乳腺癌是世界上女性发病率和死亡率最高的恶性肿瘤,在中国也是女性最常见的肿瘤。乳腺癌的远端器官转移对预后有显著影响,是乳腺癌患者死亡的主要原因。乳腺癌常见的转移器官包括骨、肺、肝、脑等。不同的肿瘤细胞优先定植转移到特定的靶器官,其成功转移取决于靶器官特异性微环境与肿瘤细胞的相互作用,但具体转移机制尚未明确。乳腺癌转移模型是筛选乳腺癌转移相关基因、研究转移嗜器官性和探究肿瘤转移分子机制的重要研究工具,现阶段乳腺癌转移模型主要集中在肺转移模型领域,且同种移植自发转移模型的建立也局限在4T1等高转移细胞系,无法准确反应转移器官特异性微环境对肿瘤细胞的影响。因此,本课题旨在探究低转移细胞系筛选自发高转移细胞亚系的一般方法以及建立乳腺癌高肝、肺转移模型。本研究选取8237例2010-2015年SEER数据库中初诊临床分期为Ⅳ期的乳腺癌转移患者,发现肺和肝转移的发生率较为近似;其次,相较于脑转移而言,肝、肺独立器官转移占比较高,属于相对独立转移的过程;相较于骨转移,肝、肺转移的肿瘤组织学分级更高、中位生存率和五年生存率更低,具有较差的预后情况。研究还发现不同的乳腺癌亚型在远端转移器官方面具有一定独特性,三阴性乳腺癌患者中发生肺转移的频率较高,而HER2+亚型有着高肝转移的风险。因此,探究乳腺癌肺和肝转移的分子机制,有助于了解肿瘤的嗜器官性转移。为了进一步探究乳腺癌器官转移的特异性,本研究选取低转移细胞系4T07,利用实验性转移模型,尾静脉或肝门静脉接种4T07,回收肝或肺转移灶细胞,体外扩增培养后,再重复两次,获得高肺/肝转移乳腺癌细胞系,之间结合肺/肝转移灶体外培养扩增,重复三次,最终获得肺/肝高转移细胞亚系及自发性肺/肝转移模型。本研究分析了所得到的细胞亚系的相关特性,基于体外细胞划痕实验和transwell细胞迁移实验结果,发现肝肺特异性转移细胞亚系的迁移能力都相较于原代细胞有了明显提升。同时我们又通过小动物活体成像和HE染色来检测器官特异性转移和体外迁移能力的变化。两株细胞亚系免疫微环境的流式细胞术结果发现,乳腺原位接种器官特异性转移株所形成的肿瘤中,Macrophage、M2和B细胞的浸润明显增多,CD47分子作为肿瘤表达的“别吃我”信号的关键分子在高转移株中也明显升高。在肝转移灶部位,正向免疫调节CD8+T细胞浸润明显降低;负向免疫调节细胞M2在其中免疫浸润有所升高。结果表明,特异性转移株所处的免疫微环境更加倾向于免疫抑制状态。此外本研究对肝、肺特异性转移株和原始株进行了测序,并且结合已知转移信息的乳腺癌原位转录组GEO临床数据和InnateDB免疫基因数据,通过WGCNA分析、hubgene筛选、无转移生存分析、独立COX回归分析等方式筛选与肺转移相关的基因,最后通过多因素COX回归分析构建了风险预测模型,得到了 3个促进肺转移的基因和3个抑制肺转移的基因。在对风险回归模型进行转移生存分析和ROC验证的基础上,我们又对6个风险基因进行综合评估,结合小鼠乳腺癌细胞系、小鼠特异性肺转移细胞系、人乳腺癌细胞系、CCLE database、GEO database和TCGA database,通过RT-qPCR、转移生存分析和乳腺癌亚型生信分析,最终筛选获得两个影响肺转移的关键基因。最后本研究对转移模型进行应用探究,实验室前期数据发现,与骨髓来源巨噬细胞来源的外泌体相比,加入肿瘤相关巨噬细胞来源的外泌体后,miR-223-3p在4T1细胞中的表达明显升高。本研究利用4T1小鼠乳腺癌肺转移模型发现miR-223-3p在这些细胞中表达量增加,并且发现在4T1中稳定过表达miR-223-3p可以促进细胞系在体内和体外的迁移和侵袭能力。据报道,Cbx5与乳腺癌的转移密切相关,它被确定为是miR-223-3p的靶点之一,根据数据库中乳腺癌患者信息,miR-223-3p与乳腺癌患者三年总生存率呈负相关,而Cbx5则呈现相反的关系。综上所述,肿瘤相关巨噬细胞来源的外泌体中包裹的miR-223-3p是其在4T1细胞中表达升高的一种新机制,外泌体中的miR-223-3p靶向Cbx5促进了 4T1的肺转移。综上所述,本课题利用实验性转移和自发性转移方式成功构建乳腺癌特异性肝肺转移细胞亚系,并且初步在体内和体外评估了该模型的特性,还运用生物信息学分析讨论乳腺癌转移的临床特征和预后,并且成功构建了乳腺癌肺转移的风险预测模型,揭示了乳腺癌器官特异性转移模型在转移机制探索和转移风险评估的应用价值。同时利用转移模型探究了影响乳腺癌肺转移的分子机制,评估了肿瘤微环境中外泌体对转移进程的影响。本研究首次建立小鼠乳腺癌低转移细胞系的器官特异性转移模型,并且可以反映体内完整的转移级联过程和免疫微环境状态,为临床转移性癌症的研究提供了新的手段。
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