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燃料乙醇仍然是目前应用最为广泛的生物质燃料；充分挖掘和利用生物质原料，从各个环节提高燃料乙醇产量、降低成本，仍然具有非常重要的意义。浓醪发酵(very high gravity fermentation，VHG)能减少能耗、提高设备利用率、降低成本，在工业生产上具有极大优势，但同时也对发酵菌种和工艺带来了更大挑战。如何实现高固含量下的快速生长发酵、提高原料利用率而高效产醇，是浓醪发酵用菌种改造需要解决的关键问题。为实现此目的，本研究进行了如下菌种改造和浓醪发酵优化评价工作：
对实验室前期构建的甘油生成下降酵母工程菌株进行玉米浓醪发酵潜力评价：对菌株Ka-4#进行了200~450g/L葡萄糖摇瓶厌氧发酵评价，显示在300g/L葡萄糖下乙醇得率(ethanol yield)最高，达到理论值的97.04%；在此基础上确定了玉米料浆30%固含量、液化、同步糖化发酵基本评价工艺体系；三因素四水平正交实验结果确定了最佳工程菌株Ka-5#，及尿素和酵母提取物的最佳添加浓度1g/L和4g/L；进一步摇瓶对比评价结果显示：菌株Ka-4#、Ka-5#和安琪酵母TH-AADY摇瓶72h内发酵最大乙醇浓度分别为136.3、142.9和132.7g/L，而最大甘油浓度分别为7.8、7.9和10.9g/L；菌株Ka-4#产醇最快，发酵24h乙醇浓度已经达到其最大值的95.3%；
将上述产醇快的菌株Ka-4#的α型单倍体和产醇终浓度高的菌株Ka-5#进行mating结合，考察所得二倍体菌株的玉米浓醪发酵潜力：首先通过交配型转换获得Ka-4#的α型单倍体菌株Kα-4#，然后将Kα-4#和Ka-5#进行结合获得二倍体菌株Kaα-1#~Kaα-10#；发酵结果显示其中的Kaα-5#菌株集中了亲本产醇快而产醇浓度高的优势；
Delta整合方法构建β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase，BG)表达菌株并进行酶活测定：先构建得到delta序列为同源臂的整合质粒pGδRU-BGL，酶切线性化后转化工业菌株单倍体衍生菌株Kα，筛选得到BG表达菌株Kα-BG1~Kα-BG7；酶活测定结果显示菌株Kα-BG2和Kα-BG6具有最高的BG总酶活，分别为0.24和0.27U/mL/OD600；
上述三类工程菌株的木薯和玉米浓醪发酵对比评价：1)建立木薯原料浓醪发酵工艺评价体系，并以菌株Ka-4#为菌种考察了固含量的影响，结果显示35%固含量下乙醇浓度最大(165.7 g/L)，但32.5%固含量对应乙醇得率最高(89.3%)；2)考察木薯和玉米糖化过程中单独添加BG的作用：在35%固含量木薯料浆和30%固含量玉米料浆的糖化步骤添加诺维信BG酶制剂，结果显示：木薯料浆糖化酶、糖化酶+BG和BG处理的最大葡萄糖浓度分别为375、415和210g/L；而玉米料浆相应处理的最大葡萄糖浓度分别为230、252和148g/L；证明BG有助于料浆葡萄糖的释放；3)对比评价32.5%固含量木薯料浆和30%固含量玉米料浆发酵效果：菌株Kα-BG2、Kα-BG6和TH-AADY对两种料浆的发酵对比实验证明Kα-BG2的最大乙醇浓度较Kα-BG6分别高3.34%、2.33%；选择四个菌株Ka-4#、Kaα-5#和Kα-BG2和TH-AADY进行72h发酵对比评价，结果显示：木薯料浆最大乙醇浓度分别为159.6、167、163.5和155.8g/L，甘油浓度分别为9.23、10.17、12.06和12.96g/L，乙醇得率分别为88.7、92.8、90.8和86.6%；玉米料浆相应分别为131.8、137.3、133.0和127.2g/L，甘油浓度分别为7.59、8.04、9.15和9.82g/L，乙醇得率分别为87.8、91.6、88.7和84.8%；对Kα-BG2以外菌株，额外添加诺维信BG的处理较仅添加糖化酶的处理，乙醇浓度增幅1.89%~3.86%不等。
综上，甘油生成下降酵母工程菌株能很好地适用于玉米和木薯的浓醪发酵，甘油生成低；而mating方法构建二倍体菌株和表达β-葡萄糖苷酶则能进一步有效改进玉米和木薯的浓醪发酵性能，加快产醇，和/或提高最大乙醇浓度和乙醇得率。
对实验室前期构建的甘油生成下降酵母工程菌株进行玉米浓醪发酵潜力评价：对菌株Ka-4#进行了200~450g/L葡萄糖摇瓶厌氧发酵评价，显示在300g/L葡萄糖下乙醇得率(ethanol yield)最高，达到理论值的97.04%；在此基础上确定了玉米料浆30%固含量、液化、同步糖化发酵基本评价工艺体系；三因素四水平正交实验结果确定了最佳工程菌株Ka-5#，及尿素和酵母提取物的最佳添加浓度1g/L和4g/L；进一步摇瓶对比评价结果显示：菌株Ka-4#、Ka-5#和安琪酵母TH-AADY摇瓶72h内发酵最大乙醇浓度分别为136.3、142.9和132.7g/L，而最大甘油浓度分别为7.8、7.9和10.9g/L；菌株Ka-4#产醇最快，发酵24h乙醇浓度已经达到其最大值的95.3%；
将上述产醇快的菌株Ka-4#的α型单倍体和产醇终浓度高的菌株Ka-5#进行mating结合，考察所得二倍体菌株的玉米浓醪发酵潜力：首先通过交配型转换获得Ka-4#的α型单倍体菌株Kα-4#，然后将Kα-4#和Ka-5#进行结合获得二倍体菌株Kaα-1#~Kaα-10#；发酵结果显示其中的Kaα-5#菌株集中了亲本产醇快而产醇浓度高的优势；
Delta整合方法构建β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase，BG)表达菌株并进行酶活测定：先构建得到delta序列为同源臂的整合质粒pGδRU-BGL，酶切线性化后转化工业菌株单倍体衍生菌株Kα，筛选得到BG表达菌株Kα-BG1~Kα-BG7；酶活测定结果显示菌株Kα-BG2和Kα-BG6具有最高的BG总酶活，分别为0.24和0.27U/mL/OD600；
上述三类工程菌株的木薯和玉米浓醪发酵对比评价：1)建立木薯原料浓醪发酵工艺评价体系，并以菌株Ka-4#为菌种考察了固含量的影响，结果显示35%固含量下乙醇浓度最大(165.7 g/L)，但32.5%固含量对应乙醇得率最高(89.3%)；2)考察木薯和玉米糖化过程中单独添加BG的作用：在35%固含量木薯料浆和30%固含量玉米料浆的糖化步骤添加诺维信BG酶制剂，结果显示：木薯料浆糖化酶、糖化酶+BG和BG处理的最大葡萄糖浓度分别为375、415和210g/L；而玉米料浆相应处理的最大葡萄糖浓度分别为230、252和148g/L；证明BG有助于料浆葡萄糖的释放；3)对比评价32.5%固含量木薯料浆和30%固含量玉米料浆发酵效果：菌株Kα-BG2、Kα-BG6和TH-AADY对两种料浆的发酵对比实验证明Kα-BG2的最大乙醇浓度较Kα-BG6分别高3.34%、2.33%；选择四个菌株Ka-4#、Kaα-5#和Kα-BG2和TH-AADY进行72h发酵对比评价，结果显示：木薯料浆最大乙醇浓度分别为159.6、167、163.5和155.8g/L，甘油浓度分别为9.23、10.17、12.06和12.96g/L，乙醇得率分别为88.7、92.8、90.8和86.6%；玉米料浆相应分别为131.8、137.3、133.0和127.2g/L，甘油浓度分别为7.59、8.04、9.15和9.82g/L，乙醇得率分别为87.8、91.6、88.7和84.8%；对Kα-BG2以外菌株，额外添加诺维信BG的处理较仅添加糖化酶的处理，乙醇浓度增幅1.89%~3.86%不等。
综上，甘油生成下降酵母工程菌株能很好地适用于玉米和木薯的浓醪发酵，甘油生成低；而mating方法构建二倍体菌株和表达β-葡萄糖苷酶则能进一步有效改进玉米和木薯的浓醪发酵性能，加快产醇，和/或提高最大乙醇浓度和乙醇得率。