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自基因工程技术广泛应用于农作物以来,转基因技术得到了快速发展。抗除草剂、抗虫、抗病、抗旱、抗寒等性状被引入到转基因作物中,提高了作物产量、降低了生产成本,使转基因作物取得了长足的发展,在世界范围内被广泛使用。但是,转基因作物对人类和环境的潜在影响尚不清楚,多年来一直备受关注,其应用也饱受争议。许多国家或地区采取强制性转基因标识条例对转基因作物进行管理,以便保护消费者的选择权和知情权。转基因大豆在转基因作物中占据主导地位,其中应用最广泛的转基因大豆品种是抗除草剂草甘膦大豆。我国每年从海外进口大量的转基因大豆,是转基因大豆进口量和压榨量最大的国家。因此,为保障消费者的选择权和知情权,迫切需要开发简便、快速、灵敏、准确的转基因大豆检测方法。本研究将跨越式滚环等温扩增(Saltatory rolling circle amplification,SRCA)技术与荧光技术相结合,首次建立了一种新型的检测抗除草剂草甘膦大豆及其制品的实时荧光跨越式滚环等温扩增(Real-time fluorescent saltatory rolling circle amplification,RF-SRCA)方法。该方法仅需一对引物,不需要人为环化过程,即可在Bst DNA聚合酶的作用下,实现对线性DNA的高效扩增。通过观察实时荧光扩增曲线即可判定试验结果。此外,还可通过可视化法和凝胶电泳法对试验结果进行分析。本研究选择抗除草剂草甘膦基因CP4-EPSPS(GenBank No.143998)为靶基因,使用Primer Premier 5.0和DNAMAN软件设计RF-SRCA特异性引物,通过大量预试验筛选出了一对特异性良好的引物。对RF-SRCA反应条件和反应体系进行优化,并建立了 RF-SRCA方法。RF-SRCA适宜的反应条件和反应体系如下:反应温度(62℃),2.5 mM dNTPs(4.0 μL),20 mM MgS04(2.5μL),10 × ThermoPol Reaction Buffer(2.0 μL),10 μM 正反向引物(各 1.5 μL),模板 DNA(1.5 μL),8 000 U Bst DNA聚合酶(8 U),荧光染料EvaGreen(1.0μL),使用无菌去离子水将反应体系补足至20.0μL。选取20种转基因作物和2种非转基因作物进行引物特异性验证。其中,5种含有CP4-EPSPS基因的转基因大豆均为阳性结果,15种不含CP4-EPSPS基因的转基因作物和2种非转基因作物均为阴性结果。结果表明:本研究设计的RF-SRCA引物具有良好的特异性。通过试剂盒法提取转基因大豆(GTS40-3-2)以及人工加标样品的基因组DNA,分别进行RF-SRCA反应,对该方法的灵敏度和检出限进行测定,并与实时荧光PCR(Real-time fluorescent PCR,RT-PCR)和实时荧光 LAMP(Real-time fluorescent LAMP,RT-LAMP)方法进行分析比较。结果表明:RF-SRCA实时荧光扩增曲线法和可视化法检测转基因大豆的灵敏度为8.8 × 100fg/μL,RF-SRCA凝胶电泳法的灵敏度为8.8 ×101 fg/μL;RT-PCR 的灵敏度为 8.8 × 102 fg/μL,RT-LAMP 的灵敏度为 8.8 × 101 fg/μL。RF-SRCA实时荧光扩增曲线法和可视化法检测人工加标样品中转基因大豆的检出限为0.01%,RF-SRCA凝胶电泳法的检出限为0.05%;RT-PCR的检出限为0.1%,RT-LAMP的检出限为0.05%。因此,RF-SRCA实时荧光扩增曲线法和可视化法的灵敏度是RF-SRCA凝胶电泳法和RT-LAMP的10倍,是RT-PCR的100倍;RF-SRCA凝胶电泳法的灵敏度是RT-PCR的10倍,与RT-LAMP具有相同的灵敏度。RF-SRCA实时荧光扩增曲线法和可视化法的检出限是RT-PCR的10倍,是RF-SRCA凝胶电泳法和RT-LAMP的5倍;RF-SRCA凝胶电泳法与RT-LAMP具有相同的检出限。本研究采用RF-SRCA方法和行业标准方法(SN/T 1204-2016)对市售的68份豆制品进行检测,结果表明:以行业标准方法为基准,RF-SRCA方法的敏感性、特异性和符合率分别为100.00%、98.41%、98.52%。综上所述,本研究建立的RF-SRCA方法可以快速、灵敏、准确、高效的检测转基因大豆及其制品中的转基因成分,为检测转基因作物提供了良好的技术平台。