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研究背景石棉是自然界存在的纤维状物质,具有保温、隔热、绝缘和隔音等性能。石棉作为工业原料和材料己有数千年的历史,目前石棉相关制品有3000多种,主要应用于汽车、化工和电器设备等工业部门。尽管石棉在工业发展中有重要作用,但是长期接触石棉可引起肺部组织纤维化,甚至诱发支气管肺癌和间皮瘤。石棉共分两大类：温石棉(Chrysotile Fibers, CF)和角闪石类石棉,在所有的石棉中,致病能力最强的是角闪石棉中的青石棉[21,但对于温石棉是否具有致癌、致纤维化的能力,还有争议。我国的政策是禁止使用角闪石石棉,安全使用温石棉。由于石棉具有致癌性,出现了人工合成的石棉替代品,称人造矿物纤维(Man-Made Mineral Fibers, MMMF),也称人造玻璃纤维(Man-Made Vitreous Fibers, MMVF),常用的品种有：玻璃棉(Glass Wool, GW)、岩棉(Rock Wool, RW)和渣棉(Slag Wool),耐火陶瓷纤维(Refractory Ceramic Fiber, RCF)等。然而有研究表明,石棉替代品同样具有生物活性和致病的可能性,其致病机理和分子机制目前尚在研究之中。温石棉及替代品的体外实验可以提供对人体的生物危害及其分子机制等信息。无嘌呤/无嘧啶核酸内切酶/氧化还原因子-1(apurinic/apyrimidimic endonuclase/redoxfactor-1, APE/Ref-1)是一种具有DNA修复、氧化还原以及调节转录因子活性的多功能蛋白；多聚腺苷二磷酸核糖基聚合酶-1(poly(ADP-ribose)polymerase-1, PARP-1)是DNA损伤感应及监测分子,其参与许多重要的生命活动如凋亡、转录、DNA修复、细胞死亡等。本项研究通过细胞毒性试验、形态学观察和分子生物学等实验方法,研究RCF1、 GW1、RW1和CF致人支气管上皮细胞(Human Bronchial Epithelial Cells, BEAS-2B)和人胸膜间皮细胞(Human Pleural Mesothelial Cells, Met-5A)损伤的作用,为探寻纤维诱发细胞病变的机理提供依据。本课题应用RNA干扰技术建立PARP-1和APE/Ref-1基因缺陷细胞株,为阐明RCF1、GW1、RW1和CF引起细胞毒性的分子机理提供细胞工具。研究目的评估RCF1、GW1、RW1和CF对BEAS-2B和Met-5A细胞的细胞毒作用。评估APE/Ref-1的PARP-1在受试纤维刺激BEAS-2B和Met-5A细胞中的作用。研究方法1.体外培养Met-5A和BEAS-2B细胞,用RCF1、GW1、RW1和CF刺激细胞不同时间后,采用MTT法测定细胞活力的大小,彗星试验检测细胞DNA损伤程度和DNA损伤修复能力,流式细胞仪测细胞的凋亡率,荧光探针DHR123和DCFH-DA测细胞内(Reactive Oxygen Species, ROS)水平,扫描电子显微镜观察细胞的形态学变化,用NAC预处理细胞2h再用受试纤维刺激细胞24h,观察纤维对细胞DNA损伤、凋亡的影响。2.20μg/cm2纤维刺激细胞后,用RT-PCR和Western Blot检测caspase-3、caspase-9、 APE/Ref-1和PARP-1的mRNA及蛋白表达水平。3.利用RNA干扰技术构建PARP-1缺陷和APE/Ref-1缺陷的Met-5A和BEAS-2B细胞系。4.沉默APE/Ref-1和PARP-1后,观察纤维对基因缺陷细胞的凋亡和DNA损伤的影响。结果1. BEAS-2B和Met-5A细胞分别暴露于浓度为5至200μg/cm2的RCF1、GW1、RW1和CF纤维24h、48h和72h后发现,在低剂量(5μg/cm2)时有刺激细胞增殖的现象,在高剂量(20、40、100和200μg/cm2)时,细胞活力下降有明显的剂量和时间反应关系。2.扫描电镜观察发现,暴露于20μg/cm2纤维的细胞出现微绒毛损失、吞噬等现象。3.细胞暴露于0～20μg/cm2纤维4h、24h和48h后,DNA损伤表现为时间依赖性和剂量依赖性增加(P<0.05)。去除纤维刺激3小时后,细胞的DNA损伤可修复。NAC对细胞DNA损伤有拮抗作用。4.分别用RCF1、RW1、GW1和CF刺激细胞后,发现细胞凋亡率增高,而GW1刺激细胞凋亡率小于其它纤维。RCF1、GW1、RW1和CF刺激细胞产生ROS的荧强度明显大于空白组。NAC对细胞凋亡和ROS产生有抑制作用。5.分别用RCF1、GW1、RW1和CF刺激BEAS-2B和Met-5A细胞后,发现caspase-3和caspase-9的mRNA和蛋白水平随着时间的增加而增加。APE/Ref-1和PARP-1的mRNA和蛋白水平随着时间的增加先增高而后下降。6.本研究利用RNAi技术分别构建了Met-5A和BEAS-2B细胞的PARP-1基因缺陷细胞株和APE/Ref-1基因缺陷细胞株,基因缺陷细胞株与正常细胞株相比,mRNA表达水平下降了70～80%,蛋白质表达水平下降了80%以上,沉默效果显著且稳定性好。7.分别用受试纤维刺激基因缺陷细胞和正常细胞,基因缺陷细胞的DNA损伤和细胞凋亡蛋白表达高于正常细胞。结论：1. RCF1、GW1、RW1和CF可诱导BEAS-2B和Met-5A细胞DNA损伤和细胞凋亡,ROS在其中起至关重要作用。2. Caspase-3和caspases-9参与RCF1、GW1、RW1和CF诱导BEAS-2B和Met-5A细胞的凋亡过程。3. PARP-1和APE/Ref-1缺陷可加重RCF1、GW1、RW1和CF对Met-5A和BEAS-2B细胞的DNA损伤程度和细胞凋亡蛋白表达。PARP-1和APE/Ref-1在RCF1、GW1、RW1和CF引起的细胞损伤中有重要作用。4.本研究用慢病毒介导的RNAi技术成功构建了PARP-1和APE/Ref-1基因缺陷细胞株,沉默效果显著且稳定性好,为后续基因功能研究提供了有效的工具细胞。