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随着社会老龄化的加剧，绝经后骨质疏松症(Postmenopausal Osteoporosis,PMOP)的发病率逐年升高，PMOP及其并发症的相关花费己经成为医疗保健系统的沉重负担。目前，PMOP仍以药物治疗为主，现有的药物在获得良好临床疗效的同时不应忽视其不良反应，因此有必要进行更多的基础研究，为开发抗OP新药打下坚实的基础。近年来，PMOP相关的基础研究中，信号通路的研究是热点之一，然而PMOP的发病是一个复杂的病理过程，己知的分子信号通路并不能完全阐明其发病机制，可能存在未被证实的信号通路，其参与PMOP的发病。课题组前期的研究对不同补肾中药的成骨效能进行对比，发现相对于六味地黄丸，金匮肾气丸更能显著提高去势大鼠的骨量、血清雌二醇水平并促进成骨细胞的增殖、分化，潜在机制与金匮肾气丸上调ERα且下调p-AMPK相关，而通过si-RNA沉默ERα后，p-AMPK的表达增高;提示在成骨细胞中，ERα可作为上游蛋白，调控AMPK的表达以及磷酸化水平，具体的调控关系尚不明确：此外，根据研究报道，在细胞的调控网络中，AMPK是Sirt1的上游激酶，而Sirt1是骨量调节的正向蛋白;这些提示ERα、AMPK、Sirt1三者之间可能通过某种级联关系调控骨代谢，共同参与PMOP的发病。因此，课题组首次提出ERα/AMPK/Sirt1信号通路的概念，在本研究中拟通过去势大鼠模型、成骨细胞系，从组织形态学、分子生物学的层面验证ERα/AMPK/Sirt1信号通路，探讨其与PMOP的联系，并通过淫羊藿苷(Icariin，ICA)干预，补充PMOP的发病机制，为该病的临床预防提供新的思路。
目的：
验证ERα/AMPK/Sirt1信号通路，探讨其与PMOP发病的内在联系，然后通过I CA干预，考察ICA是否能够通过ERα/AMPK/Sirt1信号通路预防PMOP。
方法：
1.ICA最佳浓度的筛选。通过不同浓度的ICA(10-3mM-～10-6m M)处理小鼠成骨细胞(MC3T3-E1细胞)，通过CCK8检测细胞活力，ALP染色和ALP活性试剂盒检测ALP活性，茜素红染色检测矿化结节形成情况，MDC检测细胞自噬小体形成情况，ANNEXIN V-FITCIPI凋亡试剂盒检测细胞凋亡情况，RT-qPCR检测成骨分化标志物Runx2，Osterix、OCN、OPG及ERα的表达水平，最终筛选出ICA的最佳效应浓度：
2.验证ERα/AMPK/Sirt1信号通路。细胞分4组：空白对南、组、ERα激动剂组、ERβ激动剂组、联合激动组，使用ERα、ERβ特异性的激动剂PPT和DPN处理细胞，使细胞中的ERα、ERβ过表达，MTT检测各组细胞妇活力，MDC检测各组细胞内自噬小体的表达情况，ALP染色和茜素红染色检测成骨分化情况，RT-qPCR检测成骨分化标志物Runx2、Osterix、OPG、OCN以及AMPK信号通路关键因子LKB1、Ca MKKβ、AMPKα1、Sirt1的表达，Westem Blot检测LKB1、CaMKKβ、AMPKα1、pAMPKα1、Sirt1蛋白水平的表达，免疫共沉淀CCO-IP)检测：(1)ERα与LKB1、CaMKKβ、AMPKα之间的相互作用;(2)ER?与LKB1、CaMKKβ、AMPKα之间的相互作用;
3.ICA通过ERα/AMPK/Sirt1信号通路促进成骨分化。实验分为4组：空白对照组、ICA组、ICA+ICI182780组、ICA+Compound C组。使用ERα特异性拮抗剂ICI182780以及AMPK特异性抑制剂Compound C预处理成骨细胞，RT-qPCR检测ERα、AMPK被抑制后，成骨分化标志物Collagen I、OPN、OCN、Runx2和ERα的表达以及AMPK信号通路关键因子LKB1、CaMKKβ、AMPKα1、Sirt1的表达，Westem Blot检测LKB1、CaMKKβ、AMPKα1、p-AMPKα1、Sirt1蛋白水平的表达：
4.ICA通过ERα/AMPK/Sirt1信号通路预防PMOP。通过切除双侧卵巢制作PMO P大鼠模型，动物分4组：假手术组(Sham)、病理模型组(OVX)、淫羊藿苷组(ICA)、雌二醇组(E2)，在干预12周后，显微CT检测股骨远端的骨髓参数，RT-qP CR以及WB检测ERα、LKB1、CaMKKβ、AMPKα1、Sirt1的表达。
结果：
1.相对于对照组和其他浓度组，10-5mM浓度下的ICA能够更加显著的增加成骨细胞的活力、促进成骨细胞的ALP活性和矿化结节的形成、提高细胞内自噬小体的数量、抑制成骨细胞的凋亡，同时能更加显著的促进ERα以及成骨分化标志物Runx2,Osterix、OCN、OPG的表达：
2.相对于空白对照组，ERα激动组及联合激动组能够显著增加成骨细胞的活力、促进ALP活性和矿化结节的形成、提高细胞内自噬小体的数量，同时能够显著上调成骨分化标志物Runx2，Osterix、OPG、OCN以及AMPK信号通路关键因子LKB1、CaMKKβ、AMPKα1、Sirt1的表达，同时经CO-IP检测发现ERα与LKB1及AMPKαl之间存在直接的相互作用，而与CaMKKβ无相互作用，ERβ与AMPKα1存在相互作用而与LKB1、CaMMKβ蛋白之间均无明显的相互作用;
3.相对于空白对照组，ICA能够显著促进成骨分化以及上调ERα、LKB1、CaM KKβ、AMPKα、Sirt1的表达，而经过ICI182780以及Compound C预处理细胞后，上述指标的表达明显下调;
4.相对于Sham组，OVX组的大鼠骨组织的骨儒显微参数更差，伴ERα、LKB1、CaMKKβ、AMPKα1、Sirt1的表达下调，而相对于OVX组，ICA组以及E2组能够提高这些指标的表达。
结论：
1.在本研究中，ICA的最佳效应浓度为10-5mM;
2.在成骨细胞中，存在一条ERα/AMPK/Sirt1信号通路，激活该通路能够促进成骨细胞的增殖以及成骨分化：
3.1CA能够通过ERα/AMPK/Sirt1信号通路促进成骨分化;
4.ERα/AMPK/Sirt1信号通路参与大鼠PMOP的发病，ICA能通过ERα/AMPK/Sirt1信号通路预防大鼠PMOP。
目的：
验证ERα/AMPK/Sirt1信号通路，探讨其与PMOP发病的内在联系，然后通过I CA干预，考察ICA是否能够通过ERα/AMPK/Sirt1信号通路预防PMOP。
方法：
1.ICA最佳浓度的筛选。通过不同浓度的ICA(10-3mM-～10-6m M)处理小鼠成骨细胞(MC3T3-E1细胞)，通过CCK8检测细胞活力，ALP染色和ALP活性试剂盒检测ALP活性，茜素红染色检测矿化结节形成情况，MDC检测细胞自噬小体形成情况，ANNEXIN V-FITCIPI凋亡试剂盒检测细胞凋亡情况，RT-qPCR检测成骨分化标志物Runx2，Osterix、OCN、OPG及ERα的表达水平，最终筛选出ICA的最佳效应浓度：
2.验证ERα/AMPK/Sirt1信号通路。细胞分4组：空白对南、组、ERα激动剂组、ERβ激动剂组、联合激动组，使用ERα、ERβ特异性的激动剂PPT和DPN处理细胞，使细胞中的ERα、ERβ过表达，MTT检测各组细胞妇活力，MDC检测各组细胞内自噬小体的表达情况，ALP染色和茜素红染色检测成骨分化情况，RT-qPCR检测成骨分化标志物Runx2、Osterix、OPG、OCN以及AMPK信号通路关键因子LKB1、Ca MKKβ、AMPKα1、Sirt1的表达，Westem Blot检测LKB1、CaMKKβ、AMPKα1、pAMPKα1、Sirt1蛋白水平的表达，免疫共沉淀CCO-IP)检测：(1)ERα与LKB1、CaMKKβ、AMPKα之间的相互作用;(2)ER?与LKB1、CaMKKβ、AMPKα之间的相互作用;
3.ICA通过ERα/AMPK/Sirt1信号通路促进成骨分化。实验分为4组：空白对照组、ICA组、ICA+ICI182780组、ICA+Compound C组。使用ERα特异性拮抗剂ICI182780以及AMPK特异性抑制剂Compound C预处理成骨细胞，RT-qPCR检测ERα、AMPK被抑制后，成骨分化标志物Collagen I、OPN、OCN、Runx2和ERα的表达以及AMPK信号通路关键因子LKB1、CaMKKβ、AMPKα1、Sirt1的表达，Westem Blot检测LKB1、CaMKKβ、AMPKα1、p-AMPKα1、Sirt1蛋白水平的表达：
4.ICA通过ERα/AMPK/Sirt1信号通路预防PMOP。通过切除双侧卵巢制作PMO P大鼠模型，动物分4组：假手术组(Sham)、病理模型组(OVX)、淫羊藿苷组(ICA)、雌二醇组(E2)，在干预12周后，显微CT检测股骨远端的骨髓参数，RT-qP CR以及WB检测ERα、LKB1、CaMKKβ、AMPKα1、Sirt1的表达。
结果：
1.相对于对照组和其他浓度组，10-5mM浓度下的ICA能够更加显著的增加成骨细胞的活力、促进成骨细胞的ALP活性和矿化结节的形成、提高细胞内自噬小体的数量、抑制成骨细胞的凋亡，同时能更加显著的促进ERα以及成骨分化标志物Runx2,Osterix、OCN、OPG的表达：
2.相对于空白对照组，ERα激动组及联合激动组能够显著增加成骨细胞的活力、促进ALP活性和矿化结节的形成、提高细胞内自噬小体的数量，同时能够显著上调成骨分化标志物Runx2，Osterix、OPG、OCN以及AMPK信号通路关键因子LKB1、CaMKKβ、AMPKα1、Sirt1的表达，同时经CO-IP检测发现ERα与LKB1及AMPKαl之间存在直接的相互作用，而与CaMKKβ无相互作用，ERβ与AMPKα1存在相互作用而与LKB1、CaMMKβ蛋白之间均无明显的相互作用;
3.相对于空白对照组，ICA能够显著促进成骨分化以及上调ERα、LKB1、CaM KKβ、AMPKα、Sirt1的表达，而经过ICI182780以及Compound C预处理细胞后，上述指标的表达明显下调;
4.相对于Sham组，OVX组的大鼠骨组织的骨儒显微参数更差，伴ERα、LKB1、CaMKKβ、AMPKα1、Sirt1的表达下调，而相对于OVX组，ICA组以及E2组能够提高这些指标的表达。
结论：
1.在本研究中，ICA的最佳效应浓度为10-5mM;
2.在成骨细胞中，存在一条ERα/AMPK/Sirt1信号通路，激活该通路能够促进成骨细胞的增殖以及成骨分化：
3.1CA能够通过ERα/AMPK/Sirt1信号通路促进成骨分化;
4.ERα/AMPK/Sirt1信号通路参与大鼠PMOP的发病，ICA能通过ERα/AMPK/Sirt1信号通路预防大鼠PMOP。