论文部分内容阅读
目的:类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种广泛分布于全身的,以手、腕部小关节多发的自身免疫性疾病,其错综复杂的病因和发病机理迄今为止仍未完全探明。该病遍布世界各地,各个种族均有发病,世界平均患病率为1~1.5%,我国患病率为0.34%~0.36%,以女性多发,男女比例1:3,本病在任何年龄段均可出现,以30至50岁发病最为常见。随着病程的发展,致残率不断增加,已成为导致我国青壮年劳动力丧失的主要疾病之一。RA的传统治疗药物主要包括非甾体类抗炎药、糖皮质激素类药物和改善病情的抗风湿药三大类,这些药物主要用于控制和缓解疾病症状,长期用药会产生严重的不良反应。本实验室研究报道,栀子及其单体京尼平苷(geniposide,Ge)能够显著抑制CIA大鼠血清中的致炎细胞因子IL-1β和TNF-α水平,Ge可以通过诱导细胞凋亡从而抑制CIA大鼠滑膜细胞增殖。巨噬细胞可通过分泌多种炎症介质、基质金属蛋白酶、细胞因子和生长因子等在RA关节破坏中发挥着重要的作用。京尼平苷属于环烯醚萜苷类化合物,又名栀子苷,主要存在于栀子、杜仲等中药植物中,其主要作用为抗炎、抗肿瘤、抗血栓、保护神经元,此外对于骨质疏松的治疗也有一定的疗效。本实验采用佛波酯(phorbol myristate acetate,PMA)诱导单核THP-1细胞分化为巨噬细胞,在脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)的刺激下,巨噬细胞培养上清液造成滑膜细胞RSC-364炎症模型后,加入不同浓度的京尼平苷,研究京尼平苷对巨噬细胞上清液刺激后RSC-364细胞及其信号转导通路的影响,以便进一步对该药物的特性和机理进行探讨和说明。方法:1佛波酯(phorbol myristate acetate,PMA)诱导单核细胞THP-1分化为巨噬细胞后,加入脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激获取培养上清液。2将大鼠滑膜细胞RSC-364分为对照(培养基)组,模型(上清液)组,甲氨蝶呤(methotrexate,MTX)组(1×10-6 mol/L),京尼平苷高(1×10-5 mol/L)、中(1×10-6 mol/L)和低(1×10-7 mol/L)三种剂量组,共六组。采用MTT法检测滑膜细胞增殖,分别观察滑膜细胞在24h、48h和72h后的细胞增殖率。3将分别给药后的RSC-364滑膜细胞继续培养72h,用Hoechst 33342和AO-PI双染分别进行细胞染色。在荧光显微镜下观察给予三种不同浓度京尼平苷药物后凋亡和坏死的RSC-364滑膜细胞的形态学改变。4用流式细胞仪测定对照组,模型组,MTX阳性药物组(1×10-6 mol/L),Ge高(1×10-5 mol/L)、中(1×10-6 mol/L)、低(1×10-7 mol/L)各组中的RSC-364细胞中的总DNA含量并计算细胞凋亡率。5用ELISA法分别测定对照组,模型组,MTX阳性药物组(1×10-6 mol/L),Ge高(1×10-5 mol/L)、中(1×10-6 mol/L)、低(1×10-7 mol/L)各组中RSC-364滑膜细胞上清液中的TNF-?、IL-1?、IL-6、IL-10、MMP-3和MMP-9浓度表达水平。6放射免疫法分别测定对照组,模型组,MTX阳性药物组(1×10-6 mol/L),Ge高(1×10-5 mol/L)、中(1×10-6 mol/L)、低(1×10-7 mol/L)各组中RSC-364滑膜细胞内环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,c AMP)蛋白水平。7分别提取对照组,模型组,MTX阳性药物组(1×10-6 mol/L),Ge高(1×10-5 mol/L)、中(1×10-6 mol/L)、低(1×10-7 mol/L)各组中RSC-364滑膜细胞的总RNA并进行定量和纯度测定,引物设计,用RT-PCR法测定各组细胞中的Gs、Gi基因的m RNA表达。8分别提取对照组,模型组,MTX阳性药物组(1×10-6 mol/L),Ge高(1×10-5 mol/L)、中(1×10-6 mol/L)、低(1×10-7 mol/L)各组中RSC-364滑膜细胞的总蛋白并进行定量,并用免疫印迹技术(Western Blot)检测总JNK1/2、ERK1/2、p38的蛋白表达以及磷酸化的JNK1/2、ERK1/2、p38的蛋白表达。结果:1经PMA诱导48h后的人单核细胞株THP-1细胞完全贴壁,细胞表面有伪足生成。加入巨噬细胞上清液刺激后的RSC-364滑膜细胞的生长速度较对照组(Control)明显加快。2 Ge连续作用72h,与对照组(Control)相比,模型组(Model)RSC-364滑膜细胞增殖率明显增加(P<0.01)。与模型组(Model)相比,24h和48h时MTX阳性药物组(1×10-6 mol/L)、Ge高剂量(1×10-5 mol/L)、Ge中剂量组(1×10-6 mol/L)和Ge低剂量组(1×10-7 mol/L)五组中RSC-364滑膜细胞增殖率显著降低(P<0.01或P<0.05),72h时MTX阳性药物组(1×10-6 mol/L)、Ge高剂量(1×10-5 mol/L)、Ge中剂量组(1×10-6 mol/L)三组中RSC-364滑膜细胞增殖率明显降低(P<0.01)。3经AO-PI染色后,对照组(Control)和模型组(Model)中大部分RSC-364滑膜细胞呈现出均匀的绿色荧光。Ge高剂量组(1×10-5 mol/L)、Ge中剂量组(1×10-6 mol/L)、Ge低剂量组(1×10-7 mol/L)和MTX阳性药物组(1×10-6 mol/L)四组中出现橘黄色的凋亡细胞和红色的死亡细胞,胞膜皱褶,胞核固缩或破裂,以MTX阳性药物组(1×10-6 mol/L)和Ge高剂量组(1×10-5 mol/L)中凋亡细胞最多;经Hoechst33342染色后,对照组(Control)和模型组(Model)中大部分滑膜细胞呈现出均匀的、低强度的淡蓝色荧光。随着Ge药物浓度的增加,染色体DNA发生断裂并相互聚集,并出现凋亡小体,细胞呈现出强度较高的亮蓝色荧光,以MTX阳性药物组(1×10-6 mol/L)和Ge高剂量组(1×10-5 mol/L)最为明显。4对照组(Control)和模型组(Model)细胞凋亡率分别为3.8%和4.3%,而Ge高剂量组(1×10-5 mol/L)为31.3%,Ge中剂量组(1×10-6 mol/L)为26.5%,Ge低剂量组(1×10-7 mol/L)为9.3%,MTX阳性药物组(1×10-6 mol/L)为35.6%,可见,与对照组(Control)和模型组(Model)相比,Ge高(1×10-5 mol/L)、中(1×10-6 mol/L)、低(1×10-7 mol/L)三个剂量组和MTX阳性药物组(1×10-6 mol/L)均可使RSC-364滑膜细胞凋亡率上升。5与对照组(Control)相比,模型组(Model)中的IL-1?,TNF-?、IL-6、MMP-3和MMP-9浓度水平均有明显升高(P<0.01)。与模型组(Model)比较,MTX阳性药物组(1×10-6 mol/L)和Ge三个剂量组中的IL-1?,TNF-?、IL-6、MMP-3和MMP-9浓度水平有不同程度的降低(P<0.01或P<0.05)。与对照组(Control)相比,模型组(Model)中的IL-10浓度水平明显下降(P<0.01)。与模型组(Model)比较,IL-10表达水平随Ge浓度的增加呈剂量依赖性升高,以Ge高剂量组(1×10-5 mol/L)最为明显。6与对照组(Control)相比,模型组(Model)中c AMP水平有明显下降(P<0.01)。与模型组(Model)比较,c AMP浓度水平随Ge浓度增加呈剂量依赖性升高(P<0.01或P<0.05),以Ge高剂量组(1×10-5 mol/L)最为明显(P<0.01)。与模型组(Model)相比,MTX阳性药物组(1×10-6 mol/L)c AMP水平明显升高(P<0.01)。7与对照组(Control)相比,模型组(Model)中Gi m RNA基因表达明显上升(P<0.01)。与模型组(Model)比较,Ge高(1×10-5 mol/L)、中(1×10-6 mol/L)剂量组及MTX阳性药物组(1×10-6 mol/L)均对滑膜细胞Gi m RNA基因表达有显著抑制作用(P<0.01)。与对照组(Control)相比,模型组(Model)中Gs m RNA基因表达明显降低(P<0.01)。与模型组(Model)比较,Ge高(1×10-5 mol/L)、中(1×10-6 mol/L)剂量组及MTX阳性药物组(1×10-6 mol/L)均可上调滑膜细胞Gs m RNA基因表达水平(P<0.01或P<0.05),而Ge低剂量组(1×10-7 mol/L)效果不明显(P>0.05)。8与对照组(Control)相比,模型组(Model)中p-p38、p-JNK1/2、p-ERK1/2的蛋白表达明显增强(P<0.01)。与模型组(Model)相比,Ge高(1×10-5 mol/L)、中(1×10-6 mol/L)、低(1×10-7 mol/L)三剂量组均可有效抑制p-p38、p-JNK1/2、p-ERK1/2的蛋白表达(P<0.01或P<0.05)。与模型组(Model)比较,MTX阳性药物组(1×10-6 mol/L)可以显著降低p-p38、p-JNK1/2、p-ERK1/2的蛋白表达(P<0.01)。MTX阳性药物组(1×10-6 mol/L)和Ge不同浓度组对p38、JNK1/2、ERK1/2的蛋白水平无明显影响。结论:1通过体外诱导单核细胞THP-1为巨噬细胞,用LPS刺激其分泌IL-1?,TNF-?等炎症因子,能够使RSC-364滑膜细胞过度增殖。2京尼平苷能够有效降低RSC-364细胞在炎症环境下的滑膜细胞增殖,同时影响相应促炎症因子和相关蛋白的产生和分泌。3京尼平苷通过提高Gs基因的m RNA表达,降低Gi基因的m RNA表达,使c AMP生成增加,降低RSC-364滑膜细胞的增殖和分泌。提示Ge可能通过调节G蛋白偶联信号转导通路发挥抗炎作用。4京尼平苷能够有效抑制炎症因子诱导的RSC-364滑膜细胞中p-p38、p-JNK1/2、p-ERK1/2的蛋白表达。提示Ge可能通过抑制MAPKs信号转导通路活化,进一步抑制滑膜细胞的增殖和分泌。