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1,3-丙二醇是一种重要的化工原料,它可以作为多种聚酯和聚氨酯的单体,在食品、制药等方面也有广泛的应用。甘油脱水酶是1,3-丙二醇生物合成途径中的限速酶,它的高效表达对提高1,3-丙二醇的转化速率起着至关重要的作用。因此通过对甘油脱水酶基因工程的研究,了解甘油脱水酶生物学意义及催化机理,从而提高1,3-丙二醇的生产效率,在我国实现生物转化1,3-丙二醇的工业化生产有重要意义。
本论文利用PCR技术从巴斯德梭菌(Clostridiumpasteurianum)扩增出编码甘油脱水酶基因(dhaBCE),在大肠杆菌中得到了高效表达,经SDS-PAGE分析结果显示分别有66kD、21kD、16kD三条特异性蛋白条带出现。利用金属镍亲和层析及S-300H凝胶层析将重组蛋白进行分离纯化,所得纯酶的比活为4.26U/mg。重组酶的最适反应温度范围为42~44℃,最适作用PH范围为9.10~9.50,其对三个底物结构类似物的Km值分别是,1,2-丙二醇0.38mmol/L,甘油0.29mmol/L,1,2-乙二醇2.0mmol/L。酶对反应中必需的辅酶B12的Km值为0.22μmol/L。
1998年Macis等人首次对C.pasteurianumDSM525菌株中编码甘油脱水酶的基因进行了克隆、序列分析及表达的研究,未见更深入详细的报道。本论文报道了巴斯德梭菌(C/ostridiumpasteurianum)甘油脱水酶基因的克隆、表达和纯化过程以及酶学性质的研究,进一步完善了对C.pasteurianum甘油脱水酶的了解,也为改造甘油脱水酶基因丰富了材料。