CYP17A1、CYP19A1基因变异与黔北麻羊产羔性状调控机制研究

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细胞色素P450c17(Cytochrome P450c17,CYP17A1)及细胞色素P450芳香化酶(cytochrome P450arom,CYP19A1)对卵泡发育、排卵、生殖激素的分泌及合成均具有重要作用,并影响着动物的繁殖性能。挖掘黔北麻羊产羔性状相关基因,筛选多羔分子标记有助于推进黔北麻羊多胎品系选育。本研究以CYP17A1、CYP19A1为目的基因,以经产多羔黔北麻羊母羊(3胎以上)为研究对象,采用PCR直接测序技术探究CYP17A1、CYP19A1基因多态位点与产羔性状间的关联作用,运用RT-q PCR技术检测CYP17A1、CYP19A1基因在黔北麻羊性腺轴组织m RNA水平;运用IHC检测CYP17A1、CYP19A1蛋白在卵巢组织中的定位表达;通过细胞免疫荧光鉴定所培养的卵泡颗粒细胞,随后,将构建的CYP17A1、CYP19A1基因的真核表达载体和RNA干扰载体并转染至卵巢颗粒细胞,以探究各重组质粒对颗粒细胞增殖、雌二醇及孕酮分泌和相关功能指标基因表达影响,揭示CYP17A1、CYP19A1基因在黔北麻羊的遗传效应,解析CYP17A1、CYP19A1基因调控山羊产羔性状的分子机制。研究结果如下:1.检测出CYP17A1有7个SNPs,g.59G>C、g.128G>A、g.129A>G、g.164T>C、g.2045G>A、g.4387G>A、g.4456C>T均存在两种基因型;除g.59G>C位点未偏离Hardy-Weinberg平衡(P<0.01),其余位点均显著未偏离Hardy-Weinberg平衡(P<0.01),所有突变位点的m RNA二级结构形态和最小自由能均发生改变,且各突变位点与黔北麻羊产羔数不存在相关性。CYP19A1检测出7个SNPs,g.48818C>A属于中度多态,并偏离Hardy-Weinberg平衡(P<0.01),该位点变异后也引起了m RNA二级结构和自由论均发生变化。CYP19A1基因g.48818C>A位点AA型与产羔数显著相关(P<0.05)。2.RT-qPCR结果发现,CYP17A1、CYP19A1基因在单、多羔黔北麻羊性腺轴中均有表达,且均在多羔卵巢组织中表达高于其他组织(P<0.01)。IHC结果表明在CYP17A1、CYP19A1蛋白在黔北麻羊各级卵泡和颗粒细胞中均有表达。推测CYP17A1、CYP19A1基因主要在卵巢中发挥相应的功能,间接的影响其繁殖性能。3.pEGFP-N3-CYP17A1/CYP19A1真核表达质粒和sh-CYP17A1/CYP19A1沉默表达质粒转染卵泡颗粒细胞后,其可极显著上调和下调颗粒细胞中CYP17A1、CYP19A1在转录水平的表达(P<0.01),CCK8结果表明CYP17A1、CYP19A1的过表达能促进颗粒细胞的增殖,并促进Cyclin E、PCNA、BMRP-IB、INBHA及FSHR的表达,而沉默表达后能抑制细胞增殖并抑制细胞中Cyclin E、PCNA、BMRP-IB、INBHA及FSHR的表达。此外,过表达CYP19A1、CYP17A1能促进类固醇激素E2及P4的分泌(P>0.05),其中过表达CYP17A1能显著抑制类固醇合成激素相关酶STAR(P<0.01)、CYP11A1、3βSHD的表达(P<0.05),干扰YP17A1后能抑制类固醇激素E2及P4的分泌(P>0.05),并显著促进类固醇合成激素相关酶STAR、CYP11A1(P<0.01)及3βSHD(P<0.05)的表达。过表达CYP19A1能极显著抑制类固醇合成激素相关酶STAR、CYP11A1、3βSHD的表达(P<0.01),干扰CYP19A1后能极显著促进STAR、CYP11A1及3βSHD(P<0.01)类固醇激素合成酶的表达。综上CYP17A1、CYP19A1可能通过改变CyclinE、PCNA、STAR、CYP11A1、3βSHD等基因的表达调控细胞的增殖与激素的分泌、通过影响BMRP-IB、INBHA及FSHR的表达间接影响卵泡发育,进而影响山羊的繁殖性能。
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