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植物干物质是地球上储量巨大的可再生资源。其主要成分是纤维素和半纤维素。纤维素酶能转化纤维素生产糖作为发酵原料生产酒精,作为石油的替代品,具有巨大的潜在应用前景。而纤维素酶是一种复合酶系,主要包括内切-β-1,4-D-葡聚糖酶(E.C.3.2.1.4)、外切-β-I,4-D-葡聚糖酶(E.C.3.2.9.11)和β-葡萄糖苷酶(E.C.3.2.1.21)。
福寿螺多功能纤维素酶(MFC)同时具有内切-β-1,4-葡聚糖酶(CMCase)、外切-β-1,4.葡聚糖酶和内切-β-1,4-木聚糖酶(Xylanase)酶活性,能高效分解天然纤维素,在食品、饲料、生物能源、纺织、造纸、环境保护、医药等领域具有非常广泛的用途。因此,筛选出高效表达多功能纤维素酶的草菇工程菌株,对于国民经济建设和社会可持续发展具有十分重要的意义。
本研究从T1代草菇(Volvariella volvacea)工程菌株中筛选出高产多功能纤维素酶的菌株。比较固体发酵与液体发酵对草菇工程菌株产酶的影响,建立了草菇工程菌株高产MFC的发酵培养体系,对重组多功能纤维素酶的特性进行研究。主要结果如下:
(1)对T0代转基因草菇TVM23-5和TVM23-8的担孢子进行单孢分离,获得了266个单孢菌株,PCR鉴定结果表明:其中有29株单孢菌株的基因组中仍然整合有mfc基因。通过刚果红初筛和液体发酵复筛,得到草菇工程菌株TVM5186所产的多功能纤维素酶活力最高,其Xylanase酶活力为133.64U/mL:CMCase酶活力为13.29U/mL。
(2)通过单因素试验分析麸皮粉、大豆粉、香蕉皮粉等对MFC活性的影响,确定草菇工程菌株TVM5186固体发酵主要影响因子为麸皮粉和大豆粉,适宜配比为1:1;液体发酵主要影响因子为玉米粉和麸皮粉,适宜配比为3:2。利用均匀设计分析发酵条件对该菌株产MFC的影响,结果表明:草菇工程菌株TVM5186固体发酵的最佳培养基起始pH7.4,接种量6%,温度34℃,时间10d,含水量64%,装料量18.5g,其酶活力可达到Xylanase1427.38U/g、CMCase597.59U/g:液体发酵的最佳培养基起始pn7.5,温度33℃,转速130rpm,装液量130酶mL,其酶活力可达到Xylanase38.57U/mL,CMCase10.77U/mL,
(3)草菇工程菌株发酵液经超滤、DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换层析及Sephadex G-100凝胶过滤层析,得到一种分子量为52.0KDa,SDS-PAGE电泳均一的多功能纤维素酶。
对重组多功能纤维素酶性质研究表明:该酶对CMC-Na的水解活性在50℃最高,最适pH为pH6.0。对Xylan的水解活性在55℃最高,最适pH为5.5。多功能纤维素酶在20-50℃范围内,pH在5.0-8.0范围内具有较高的稳定性。金属离子对酶活性的影响实验表明:Mn2+对多功能纤维素酶活性有强烈的抑制作用。组分动力学性质的研究表明:多功能纤维素酶对Xylan的亲和力比CMC-Na好。