海参卵黄蛋白抗炎活性及机制研究

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海参是一种名贵的药食同源水产品,具有很高的经济价值和营养价值。我国海参养殖区主要分布在黄渤海沿岸,不同生长环境可能会对海参营养品质和功能活性产生影响。为了全面挖掘海参功能活性及其功效成分,本文分析了多地域和多季节海参的营养成分变化。海参主要可食部分为体壁,其包含多种活性成分,如多糖、必需氨基酸、多不饱和脂肪酸和其他生物活性物质等。研究表明食用海参具有降血糖、降血脂、提高免疫力等生物功能,而这些慢性疾病的发生往往伴随着炎症反应,但是海参是否通过抑制炎症反应进而发挥上述功能以及能够发挥抗炎活性的具体功效成分却鲜有报道。本研究首先对不同地域和季节的海参营养成分进行综合评价分析,并通过动物实验对海参及其主成分的抗炎活性进行评价,利用蛋白质组学的方法筛选出具有抗炎活性潜力的高丰度卵黄蛋白,建立卵黄蛋白分离纯化的方法,进一步对其抗炎活性及作用机制进行初步解析,主要的研究内容如下:(1)海参体壁主要营养成分的研究:文中选取4个有代表性养殖地域分别在春季和秋季捕捞的海参为研究对象,分析了体壁中蛋白质、多糖、脂类、氨基酸、脂肪酸和矿物元素等营养成分的含量,结果表明营养成分的含量受季节和地域影响,但是季节对其影响更为显著。对海参营养成分分析时,主成分累积贡献率为74.6%,主要贡献营养成分是氨基酸、脂肪酸和多糖。(2)海参及其主成分抗炎活性的研究:本章将海参及其主成分按不同剂量(分别是50、100和300 mg/kg)灌胃结肠炎小鼠,验证小鼠的抗炎活性。实验结果表明海参组临床评分降低,结肠黏膜组织修复和抗炎因子IL-4和IL-10分别增加了39.7%和33.1%,表明海参具有缓解结肠炎的活性。为了进一步找出海参中具有抗炎活性的主要功效组分,将海参分成三个组分:脂类提取物、多糖和蛋白,随后分别灌胃结肠炎小鼠。实验结果表明低剂量海参多糖和所有蛋白组均具有缓解结肠炎的功能,主要表现在小鼠稀便和血便症状减轻、髓过氧化物酶降低、结肠缩短症状减轻、粘膜组织修复、促炎因子(TNF-α,IL-6,TGF-β和IFN-γ)含量降低以及抗炎因子(IL-4和IL-10)含量升高,尤其是高剂量蛋白组抗炎效果最佳。(3)基于蛋白组学的方法筛选卵黄蛋白并对其进行分离纯化及鉴定研究:利用TMT定量蛋白组学的方法探究不同地域和季节中海参蛋白的组成和含量,结果表明海参卵黄蛋白是一种高丰度蛋白。然后采用三步分离沉淀的方式提取卵黄蛋白,并测定卵黄蛋白的纯度为88.54%,分子量为2.0×10~6 k Da。接着通过质谱鉴定和结合蛋白数据库检索,研究表明卵黄蛋白由4种亚基组成,他们的分子量分别是171 k Da、123 k Da、79 k Da、59 k Da。电泳条带通过考马斯亮蓝、高碘酸-希夫碱、甲基绿-钼氨酸和苏丹黑B染色后,在同一部位均呈阳性反应,表明卵黄蛋白是一种高分子量的糖磷脂蛋白,且分子间有二硫键。另外结合生物信息学分析,卵黄蛋白具有转铁蛋白的基序,而转铁蛋白具有抗炎活性,由此推测卵黄蛋白是海参蛋白组分中发挥抗炎的主要功效因子。(4)海参卵黄蛋白抗炎活性及作用机制研究:将不同剂量的卵黄蛋白灌胃结肠炎小鼠,结果证实卵黄蛋白可以缓解小鼠结肠炎,尤其是中剂量(100 mg/m L)和高剂量(300 mg/m L)的卵黄蛋白可以明显增加结肠炎小鼠结肠的隐窝长度、减轻黏膜损伤和降低炎症细胞浸润,而且灌胃剂量越高,效果越显著。另外对卵黄蛋白缓解结肠炎的机制进行初步探讨,卵黄蛋白增加了厚壁菌和拟杆菌水平,降低了幽微菌数量,同时促进短链脂肪酸含量的增加。进一步利用分子对接的方法对卵黄蛋白抗炎机制进行预测,结果表明卵黄蛋白可能通过抗炎肽段与结肠炎靶点结合抑制炎症反应进而发挥抗炎功效,另外短肽FL和SYF可以通过多靶点发挥抗炎功效,而AFPAL只作用IL1B靶蛋白。综上,本文首先利用蛋白组学技术筛选出卵黄蛋白,并建立了卵黄蛋白分离纯化的方法。进一步通过DSS诱导结肠炎模型,揭示了卵黄蛋白是海参发挥抗炎活性的主要成分,并对其可能的作用机制进行了初步探讨。总之,通过动物实验和分子对接等手段解析了海参中卵黄蛋白可以缓解结肠炎,为以后功能食品的开发提供了发展思路和数据支撑。
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