研究背景横纹肌肉瘤(Rhabdomyosarcoma,RMS)是起源于间叶组织,具有遗传多样性的骨骼肌分化来源的软组织恶性肿瘤。目前,手术结合化疗或者放疗仍然是横纹肌肉瘤标准的治疗策略。然而,最近几年,患者的5年生存率未能进一步提高。在横纹肌肉瘤患者的肿瘤治疗过程中,耐药和转移是导致治疗失败的主要原因。一些随机化化疗试验尽管引进了新的或更密集的治疗策略,但是疗效并未明显改善。因此,临床上迫切需更多有效的治疗策略。最近的研究从分子细胞生物学、分子细胞遗传学的角度深入探究了横纹肌肉瘤的发生机制,从而为开发新的肿瘤治疗靶点和/或策略提供理论基础。细胞自噬是一种复杂的自我消化、平衡代谢的机制,其作用是维持细胞的内稳态。根据自噬膜包裹底物及运送细胞器并降解的方式不同,可以将细胞自噬分为微自噬、巨自噬和分子伴侣介导的自噬。在细胞自噬过程中,细胞自我识别机制转运功能障碍的蛋白和细胞器至溶酶体内降解,使细胞内的功能元件不断更新,维持细胞内环境的稳定。这有利于细胞消除病原体,冗余的蛋白和损伤的线粒体,并且可以利用废弃的蛋白质提供氨基酸以满足机体的代谢需求。近年来,自噬与细胞内其他新陈代谢反应,例如细胞的有丝分裂、迁徙、糖代谢、炎性反应和肿瘤的生物学行为等有着密切的联系。自噬和肿瘤之间的关系较为复杂,自噬既能抑制肿瘤的发生,又有促进其发生发展的作用,并且使肿瘤组织具有抵抗放化疗的能力。自噬通过清除细胞内的损伤和毒性成分扮演着肿瘤抑制者角色。然而,一旦肿瘤形成,细胞自噬的保护作用就转变为不利因素,比如自噬使得肿瘤细胞适应能量危机、环境压力因素和对抗放疗、化疗药物的杀伤作用。科学研究也证明,抑制自噬在肿瘤的治疗过程中起到积极有效的作用。即使在氧充足的条件下,肿瘤细胞和快速增殖的细胞也趋向于利用葡萄糖的糖酵解途径提供能量,这一现象称为有氧酵解,也就是著名的瓦博格效应(Warburg effect)。虽然糖酵解过程的能量利用率显著低于氧化磷酸化过程,但是糖酵解过程产生大量的生物合成所需的基础原料,以满足肿瘤细胞及快速增殖细胞的合成代谢需求。6磷酸果糖2激酶/果糖2,6二磷酸酶同工酶3,PFKFB3(6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-bisphosphatase isoform 3)是糖酵解过程中的关键调节蛋白,虽然不是糖酵解过程的限速酶,但是其催化产物果糖-2,6-二磷酸(F2,6BP)可以有效的别构激活糖酵解过程的关键限速酶6磷酸果糖1激酶(6-phosphofructo-1-kinase,PFK-1),从而促进糖酵解途径。PFKFB3在快速增殖组织和肿瘤组织中被刺激激活,并呈现高表达趋势,包括乳腺癌,前列腺癌,结肠癌,星形细胞瘤,卵巢癌,胰腺癌和胃癌等,其表达或活性的升高与癌症的侵袭性和预后不良密切相关。研究证实PFKFB3能够在细胞核内定位,说明细胞核内染色质代谢的能量主要是以糖酵解依赖的方式提供的,因此PFKFB3在细胞增殖中起着重要作用。目前,PFKFB3的抑制剂也已经开发,例如3-(3-吡啶基)-1-(4 吡啶基)-2-丙烯-1-酮(3-(3-pyridinyl)-1-(4-pyridinyl)-2-propen-1-one,3PO)。也有学者在3PO的基础上,研发新的衍生物,筛选出对人重组PFKFB3蛋白具有更高抑制活性的化合物1-(4-吡啶基)-3-(2-喹啉基)-2-丙烯-1-酮(1-(4-pyridinyl)-3-(2-quinolinyl)-2-propen-1-one,PFK15)。PFK15 作为一种新型PFKFB3抑制剂,它具有强大的抗肿瘤活性并且能够显著降低葡萄糖类似物,氟代脱氧葡萄糖(18FDG)摄取和移植肿瘤的F2,6BP含量,同时,这种新型化合物对体外细胞转化和体内肿瘤均具有强效和快速的促凋亡作用。在我们的研究中,我们发现PFK15能够抑制横纹肌肉瘤细胞的基础自噬,与此同时抑制了 AMPK(AMP-activated protein kinase)信号通路的活性。文献报道AMPK信号在细胞自噬中起着双向的作用,既能够促进自噬,也能够抑制自噬。在利用荧光显微镜和电镜的方法观察PFK15对横纹肌肉瘤RD细胞自噬的影响时,我们往往能够观察到细胞核异常的情况,而核异常是细胞核损伤的标记物,常用于筛选具有遗传毒性的药物。本研究以RD细胞为研究对象,将有氧酵解、细胞自噬、AMPK信号通路,及细胞核的稳定性联系起来,有助于更好的理解细胞自噬的调节机制,以及细胞自噬对肿瘤生存的影响,为横纹肌肉瘤的治疗提供新的靶点和理论基础。研究目的1.研究糖酵解在横纹肌肉瘤细胞代谢中的意义,评估PFKFB3抑制剂PFK15对RD细胞糖酵解的作用。2.评价PFK15对RD细胞增殖的影响,细胞活力的影响。3.探究PFK15对RD细胞自噬的影响。4.探究PFK15对RD细胞核损伤的影响及凋亡的影响。5.研究PFK15对糖代谢、自噬等信号通路的影响及其作用机制。6.探究参与PFK15在体内抑制横纹肌肉瘤的作用效果。研究方法1.用不同浓度的PFK15作用于体外培养的人类横纹肌肉瘤细胞系RD,通过测定培养上清中的乳酸含量,评价PFK15对人类横纹肌肉瘤细胞的糖酵解的影响情况并选出PFK15的最佳作用浓度。2.利用最佳作用浓度的PFK15作用于RD细胞,通过MTSL比色法,克隆形成测定法,免疫印迹法分别评价PFK15对肿瘤细胞系增殖情况,活力和信号传导途径的影响。3.利用最佳作用浓度的PFK15作用于RD细胞,借助荧光显微镜、免疫印迹、和透射电镜检测PFK15对自噬的影响,通过自噬流抑制剂和检测自噬底物SQSTM1/p62等方法检测分析PFK15对细胞自噬流的调节。4.利用siRNA沉默Atg5和Atg7基因建立自噬抑制模型,借助于免疫印迹法评价PFK15对caspase依赖型细胞凋亡标记物PARP-1切割的影响。5.评价PFK15对RD细胞中磷酸化的Akt(pAkt)的表达水平的调节,对磷酸化的AMPK(pAMPK)和其底物磷酸化ACC(pACC)的表达水平的影响。并与3PO对RD细胞中pAMPK和其底物pACC的抑制情况进行对比。6.应用AMPK信号激动剂AICAR处理RD细胞后,再给与PFK15处理,借助MTS比色法,克隆形成测定法和免疫印迹法,观察PFK15对RD细胞活性的影响,自噬影响和信号通路影响。7.在siRNA沉默Atg5和Atg7的自噬抑制模型基础上,PFK15联合CQ与PFK15单独作用后,借助免疫印迹方法评价核损伤标记物RAD51和H2AX表达量情况。8.构建了裸鼠的实体瘤模型,观察PFK15对横纹肌肉瘤体内增殖的影响。研究结果1.PFK15显著抑制了 RD细胞中的糖酵解,并且呈剂量依赖性。与对照组相比,4 μM和6 μM的浓度PFK15使乳酸产量显著减少了 20%和27%。因此,选取6μM为PFK15的最佳作用浓度。2.PFK15抑制RD细胞的增殖并引起异常的细胞核形态。PFK15处理的细胞核膜的完整性受到破坏,并且在核中检测到突起,核凝聚,并且突起与核分离,在细胞质中形成小核。3.用MTSL比色法检测细胞活性。PFK15与对照组相比明显降低了 RD细胞的活性。用糖酵解关键酶己糖激酶(Hexokinase2)抑制剂3BP(25μM)处理时,细胞活力也显著显著降低。此外,当用PFK15联合细胞自噬起始抑制剂3MA(1 mM)处理时,细胞活力进一步降低,表现出较强的协同作用。4.在电镜检测中,PFK15明显减少细胞质中膜空泡的积累。而在免疫印迹试验中,PFK15基本没有增加LC3-Ⅱ的蛋白水平,也未能促进自噬底物p62的降解。而PFK15联合自噬流抑制剂CQ处理组的LC3-Ⅱ水平相对于PFK15单独处理组没有进一步增加,自噬底物p62也没有变化甚至是降低,说明PFK15抑制自噬流。5.在免疫印迹实验中,PFK15可以诱导PARP-1的切割,并且呈现为剂量依赖的方式,表明PFK15可以诱导caspase依赖型细胞凋亡。而敲降Atg5和Atg7部分抑制了 PFK15诱导的PARP-1切割。6.PFK15处理后,肿瘤细胞内磷酸化的AMPK和其底物pACC的水平分别下降44%和20%,PFKFB3的另一种抑制剂3PO也获得类似的结果,说明AMPK信号通路可能参与这一过程。7.PFK15处理后还激活自噬的负向调节因子mTOR复合物Ⅰ以及pAkt信号通路,从而抑制了 RD细胞的自噬。8.与单独的PFK15相比,AMPK激动剂AICAR减弱了PFK15对RD细胞的活性丢失,自噬抑制和信号通路的调控作用。9.在敲降Atg5和Atg7抑制自噬的模型中,PFK15影响了细胞核损伤修复蛋白RAD51和组蛋白H2AX的水平,这表明刺激导致了核损伤。10.PFK15注射组的小鼠体内实体瘤体积及重量相对于对照组相比显著降低,说明PFK15抑制了横纹肌肉瘤细胞的体内增殖。研究结论1.PFK15降低RD细胞糖酵解能力。2.PFK15能降低RD细胞的存活率,并能够抑制细胞克隆形成。3.PFK15处理增加了 RD细胞的小核现象,并抑制RAD51的表达水平和升高了 H2AX蛋白的水平,这是DNA的损伤的表现。4.PFK15在体内能够明显抑制肿瘤的生长。5.PFK15抑制RD细胞的自噬流。6.PFK15可以诱导RD细胞凋亡,可被早期自噬的抑制所抑制,也就是说自噬起到一定的保护作用。7.PFK15抑制RD细胞的AMPK信号通路。8.PFK15能够显著上调p-Akt的表达和p-mTOR的水平。9.应用AMPK激动剂能够减弱PFK15对细胞活性、自噬及AMPK的抑制作用。PFKFB3可能作为AMPK的上游功能调节因子。