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手性药物分子含有不对称中心，临床上多以外消旋体形式给药。手性药物在体内的分布与代谢过程常存在立体选择性，导致对映体常具有不同的药代动力学性质。由于受分析方法灵敏度的限制，仍有较多临床上使用的手性药物立体选择性药代动力学性质未被揭示。近年来手性固定相和大气压离子化串联质谱技术的发展为该项研究提供了新的推动力，但如何将手性色谱分离技术同串联质谱检测技术结合以缩短色谱分析时间和获得高的检测灵敏度仍是有待解决的问题。本文拟选择临床上常用的手性药物昂丹司琼、亚叶酸钙和多沙唑嗪为研究对象，探索建立手性LC-MS/MS生物样品分析方法的一般策略，并用于体内立体选择性药代动力学及机理研究。
一、昂丹司琼人体内立体选择性药代动力学研究
本研究建立了手性LC-MS/MS分析方法测定人血浆中昂丹司琼对映异构体。血浆样品在碱性条件下经乙酸乙酯液-液提取后，采用甲醇：5mM醋酸铵：乙酸(20：80：0.02，v/v/v)为流动相，经ES-OVM柱进行对映体色谱分离，流速为0.40mL/min。在API4000型串联质谱仪上以多反应监测(MRM)进行检测，单一对映体的定量下限均为0.10ng/mL，比文献报道方法提高了100倍，每个样品的色谱分析时间为12.5min。
4名健康受试者静脉滴注8mg昂丹司琼消旋体后，采用经过确证的手性LC-MS/MS分析方法测定对映体血浆药物浓度。R-(-)-和S-(+)-昂丹司琼的AUCo0-∞(μg/L·h)分别为140±32.5和120±31.1，CLT(L/h)分别为29.7±6.8和35.0±8.8，且在每个采样时间点R-(-)-昂丹司琼血药浓度均高于S-(+)-异构体，R-(-)/S-(+)比值恒定在1.2左右，证明昂丹司琼在人体内的药代动力学过程存在立体选择性。采用超滤法测定血浆中昂丹司琼对映体的游离浓度，R-(-)-异构体与S-(+)-异构体血浆中的游离百分比分别为3.7％和5.3％，证明昂丹司琼对映体血浆蛋白结合存在明显的立体选择性。
由于分析方法灵敏度的突破，本文采用手性LC-MS/MS法首次研究了昂丹司琼人体内立体选择性药代动力学，结果表明，昂丹司琼对映体血浆蛋白结合差异可能是导致体内立体选择性药动学的主要原因。
二、左亚叶酸与亚叶酸人体内药代动力学比较研究
本研究首次采用ChirobioticT柱结合MS/MS检测对血浆中6R-亚叶酸、6S-亚叶酸和5-甲基四氢叶酸进行分离测定。血浆样品采用先沉淀蛋白后固相萃取的预处理方法。流动相为10mM三氟乙酸铵甲醇：乙酸(100：0.2，v/v)，流速为1.0mL/min。6R-亚叶酸和6S-亚叶酸的血药浓度线性范围均为0.050-20.0μg/mL，5-甲基四氢叶酸为0.025-10.0μg/mL。本研究另外以10mM醋酸铵甲醇为流动相分离了5-甲基四氢叶酸非对映体，通过分析受试者血浆样品发现体内无6R-5-甲基四氢叶酸生成，说明无需对5-甲基四氢叶酸非对映体进行分离测定。采用建立的手性LC-MS/MS分析方法对左亚叶酸和亚叶酸人体内药代动力学进行了比较研究。中国健康受试者分别静脉滴注125mg/m2亚叶酸钙和62.5mg/m2左亚叶酸钙后，6S-亚叶酸和5-甲基四氢叶酸的主要药代动力学参数均无显著性差异，证明了6R-亚叶酸不影响6S-亚叶酸和5-甲基四氢叶酸体内的药代动力学行为。
三、多沙唑嗪体内立体选择性药代动力学研究
本研究建立了非手性/手性LC-MS/MS分析方法测定生物样品中多沙唑嗪。手性LC-MS/MS分析方法以甲醇：5mM醋酸铵水溶液：甲酸(20：80：0.016，v/v/v)为流动相，采用ES-OVM柱分离对映异构体，单一对映体的定量下限均为0.10ng/mL，与非手性分析方法具有相同的灵敏度，每个样品的色谱运行时间为9min。应用所建立的分析方法研究了多沙唑嗪在大鼠、比格犬和人体内的立体选择性药代动力学。在大鼠体内，多沙唑嗪对映体在除胃和小肠的各组织中的分布均存在显著的立体选择性，S-(+)-异构体浓度高于R-(-)-异构体，S-(+)/R-(-)比值在2.53～30.7之间。在比格犬体内，Cmax和AUC0-t的S-(+)/R-(-)比值分别为7.8和16.2。在人体内，Cmax和AUC0-t的S-(+)/R(-)比值分别为2.1和2.3。
通过肝微粒体实验从代谢角度研究了多沙唑嗪立体选择性药代动力学机理。多沙唑嗪消旋体经犬肝微粒体孵化后，R-(-)-异构体的代谢程度远高于S-(+)-异构体。采用LC/MSn分析方法研究了多沙唑嗪对映体在肝微粒体中的代谢情况。共发现8种代谢产物，其中5中单羟基化代谢产物，2种氧去甲基代谢产物，1种哌嗪环羟基化后脱水代谢产物。其中新发现的18位手性碳上羟基化代谢产物M2-IV为决定立体选择性代谢的关键产物。
本文在建立测定生物样品中手性药物对映体LC-MS/MS分析方法时，着重手性固定相的选择与流动相系统的优化，使得流动相系统与API串联质谱兼容，以提高检测灵敏度和缩短对映体色谱分离时间。本文所建立的测定血浆中昂丹司琼和多沙唑嗪的手性LC-MS/MS分析方法灵敏度适用于立体选择性药代动力学研究，本文同时对它们立体选择性药代动力学机理进行了初步探讨。