目的 败血症是细菌侵入血液循环系统并在血中大量繁殖，造成机体严重损伤和全身性中毒等症状的严重的全身细菌感染性疾病，属于一种临床上常见病。细菌感染的有效治疗要求快速和准确的诊断。但是，传统上的临床病原菌检测，常规用血培养的方法，一般需要4～7天时间，常延误了临床治疗，并且，血培养受多种因素影响，阳性率并不很高，会导致败血症的漏诊。 PCR是1983年发展起来的一种分子生物学诊断方法，研究证实用PCR法检测败血症病原菌的阳性率明显高于血培养。此方法操作简单、快速、敏感性高，但是会出现假阳性结果，而且它仍然无法鉴别致病菌的种类，从而限制了它的应用范围。 使用基因芯片可以解决上面提到的难题。我们构建的基因芯片模型是在PCR扩增基础上，利用多种探针对败血症的致病菌种类进行快速而准确的检测，它已成为疾病诊断的最为有力的工具之一。基因芯片(Gene chip)的检测原理为将许多特定的寡核苷酸片段或基因片段作为探针，有规律地排列于支持物上，每平方厘米内可排列近千个点。然后与待测的标记样品的基因按碱基配对原理进行杂交，再通过激光共聚焦荧光检测系统等对芯片进行扫描，并配以计算机系统对每一探针上的荧光信号作出比较和检测，从而迅速得出所要的信息。由于基因芯片可以包含的信息非常多，可以集中多达几千种探针信息，而临床常见的细菌感染也不过几十种，所以基因芯片能够轻松地完成基因检测任务。 方 法 1．细菌染色体DNA的提取：应用酚氯仿的方法进行提取 2．16S：DNA PCR扩增：采用常规 PCR扩增方法 3．寡核耷酸探针设计和合成 4．基因芯片制备 结 果 1．以 10种标准菌株提取的DNA为模板，进行PCR扩增，均获阳性DNA条带，与DNA Markers相对照，扩增产物为308hp，与设计相符合。 2．致病菌DNA的PCR扩增产物与所制作的芯片进行杂交，结果显示致病菌DNA只与相应的检测探针杂交，而且对于大多数探针来说，40℃2小时的杂交条件具有高度的灵敏度和特异性。 讨 论 利用基因芯片检测致病菌杂交反应是关键而又复杂的过程，受许多因素影响，包括以下几个方面： l．杂交序列长度的影响。由于芯片检测的机理是基于Wat－son－Crick配对规则，完全配对的双链要比存在错配碱基的双链分子具有较高的热力学稳定性，因此，产生的荧光信号强度要高5－30倍，一般来讲，短的杂交序列更容易区分碱基的错配，但稳定性差一些。我们在实验过程中采用20个左右碱基的寡核耷酸探针，取得了较好结果。 2．探针浓度对杂交结果的影响：探针溶在探针缓冲液中，浓 ·2·度分别为50pM＊ 和200卜M。在40℃下杂交2小时，如果探针是用手点的，则 50 pM＊ pM的探针浓度杂交效果好，200 pM探针浓度无杂交信号；如果探针是用点样仪点的，则100pM和200 pM的探针浓度杂交效果好，两者无区别，但是 50 pM探针浓度杂交信号较弱。 3．杂交序列中G＋C含量的影响：在基因芯片检测中，序列组成是最不确定的参数，由于G人间形成三个氢键，而AJ间形成两个氢键，所以从理论上讲，富含G＋C的区域杂交稳定性较好。考虑到在一次基因芯片检测中将会形成几十个，甚至成百上千个异源杂交物，所以有必要筛选出最佳的反应条件。由于G＋C含量直接决定着杂交反应的温度屈此，在设计检测探针时非常重视G＋C含量，尽量做到各个探针的杂交温度一致。 4．杂交温度和杂交时间对杂交结果的影响：杂交温度和杂交时间是二个比较重要的指标，而且它们之间具有一定的联系，一般杂交温度高的时候，需要较短的杂交时间，而杂交温度低的时候，杂交时间需要延长。而且片段的长度与杂交时间成正比，杂交片段越长，所需的杂交时间也越长，甚至有的需要杂交过夜。在40 t下，分别用30min、60min、90而n、120min杂交，结果显示40℃120ndn杂交效果优于其它杂交时间。不仅杂交信号强，而且特异性也较好。另外，在120min下，分别用40℃／5℃J0℃J5℃和60t杂交，结果显示120min／0℃杂交效果好，从而最佳杂交条件为40℃＊ 分钟。杂交温度最好不超过Tin值，在Tin至（Tin－lo）℃最好。 5．基因芯片检测致病菌灵敏度、特异性与重复性：基因芯片检测致病菌的灵敏度是由制备模板的PCR灵敏度所决定的，即PCR的灵敏度等于基因芯片的灵敏度，经PCR方法扩增后，最底能检测 lpg大肠杆菌，相当于 3个致病菌，证明该检测方法具有高度灵敏度及特异性。 ·3· 结 论 O）基因芯片可以同时对多种败血症致病菌进行并行检测，一次实验即可得出全部结果。 p）对败血症的诊断过程简便、快速，整个检测6－7小时即可以出结果。 p）诊断结果特异性强、灵敏度高。